早期测定胡椒碱的方法主要是凯氏定氮法、称重法、甲醛释放法等，但由于其操作繁琐 测定的胡椒碱不准确。因此主要介绍近几年应用广，方法可靠的胡椒碱测定方法。目前检测胡椒碱，最常用的方法是高效液相色谱法(HPLC)，薄层色谱法毛细管电泳法，紫外分光光度法，极谱法等。
1 薄层色谱法
薄层色谱是近几年发展的一种微量，快速分离和定性的实验技术。属于固-液吸附色谱。薄层色谱具有样品用量少、有机溶剂消耗少、检测迅速无固定相污染等优势。
胡椒碱的薄层色谱定量法，在GF254 硅胶板上，用甲苯：乙酸乙酯：乙醚(6：3 ；1)的二元展开体系将胡椒碱有效的分离。分离后的试样在波长337 nm下扫描定量，胡椒碱的线性范围为 15~75 ng 加标回收率为 94.53% 表明高效薄层色谱法能够作为检测胡椒碱的一种简便、快速扫描和定量方法。
2 液相色谱法
液相色谱(HPLC)法是测定胡椒碱最成熟的方法之一。它以其分离度高、准确、快速等优点在检测生物活性物质领域得到广泛的应用。胡椒碱在3~150 g/mL 时峰面积与浓度呈良好的线性关系，相关系数 0.999 4 胡椒碱的检测限为 1.2 g/mL，胡椒幼果中胡椒碱的含量为 4.153 mg/g 成熟果中胡椒碱的含量为 27.2 mg/g 胡椒花不含胡椒碱。反相高效液相色谱法测定胡椒根中胡椒碱的含量，采用色谱柱为 Luna C18 柱(250 mm*4.60 mm， 5um) 流动相为甲醇：水(77：23) 流速为 1.0 mL/min 检测波长为 343 nm 柱温为 35。C。
3 毛细管电泳法
毛细管电泳是以弹性石英毛细管为分离通道以高压直流电场为驱动力、依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的电泳分离分析方法。它具有分离效率高、速度快、灵敏度高、所需样品少、成本低等特点。
细管电泳法测定了白胡椒中胡椒碱的含量，电泳条件为石英毛细管柱(50 um *90 cm,实际长度81.5 cm) 运行，缓冲液0.02 mol/L Na2HPO4 ，0.02 mol/L NaH2PO4 ＝95: 5(16 。C时 pH ＝8.6) 分离电压为 28kV 压力进样 30 mbar *8 s ，温度为 25。C， 检测波长为 343 nm。
4 紫外分光光度法
紫外分光光度法是利用胡椒碱结构上的苯环以及共轭双键 因而具有独特的吸收光谱 利用胡椒碱能吸收紫外光的性质可以对胡椒碱进行测定。胡椒碱的乙醇溶液在紫外光谱区 342 nm处有一个的吸收峰 利用该峰建立了紫外分光光度计测定胡椒碱含量的方法 该法测定的胡椒碱在浓度为 0 70 g/mL 范围内服从比耳定律。但是其他的生物碱例如胡椒林碱 胡椒亭碱以及其他一些在此波长下也有吸收值的物质会对测定的结果造成干扰，因此紫外分光光度法测定的胡椒碱含量通常会比真实值偏高。
5 极谱法
由于胡椒碱有两个 C＝ C在酸性条件下可在滴汞电极上发生还原反应，从而产生极谱峰。胡椒碱在 -1.01 V(vs.SCE)左右pH 值为2.2 的 Britton-Robinson 缓冲溶液中产生灵敏的极
谱峰，建立了峰电流与胡椒碱浓度在 0.05 8 g/mL范围内的相关曲线 结果表明采用极谱法测定的胡椒碱简单 快速 灵敏 但由于滴汞电极中汞蒸气有毒以及汞电极在较正电位下容易氧化等因素，使得极谱法应用的范围越来越小。