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HPLC测定金银花提取物中绿原酸的含量
建立金银花提取物中绿原酸含量的HPLC测定方法。方法国产C18柱（4．6mm×250mm，7μm）；流动相为乙腈：0．4％磷酸（12：88）；检测波长为327nm；流速1ml·min^-1；选样量10μl；柱温25％。结果绿原酸在0．0716～0．6444μg范围内线性关系良好，r=0．9996；平均回收率99．99％，RSD=1．61％（n=6）。结论该方法简便、快速、准确，可用于金银花提取物的含量测定及质量控制。
目的建立金银花提取物中绿原酸含量的hplc测定方法。方法国产c18柱（4.6 mm×250 mm,7 μm）;流动相为乙腈：0.4%磷酸（12∶88）；检测波长为327 nm；流速1 ml·min-1；进样量10 μl；柱温25℃。结果绿原酸在0.071 6～0.644 4 μg范围内线性关系良好，r=0.999 6；平均回收率99.99%，rsd=1.61%（n=6）。结论该方法简便、快速、准确，可用于金银花提取物的含量测定及质量控制。
【关键词】 金银花提取物；上禾生物 ；绿原酸； 高效液相色谱法
determination of chlorogenic acid in the extract of flos lonicerae by hplc
liu lei, he zai＇an , yu zichuan, liu chaoying, liu yanwen*
(key laboratory of resource science and compound recipe in chinese medicine of ministry of education hubei college of tcm, wuhan 430061，china)
abstractobjectiveto establish a method for the determination of chlorogenic acid in the extract of flos lonicerae.methodsthe chromatographic conditions were as follows: c18 chromatographic column (4.6 mm×250 mm,7 μm)，a mobile phase of acetonitrile and 0.4% h3po4(12:88)，the detection wavelength at 327 nm and the flow rate being 1 ml·min-1. resultsa linearity of chlorogenic acid in the extract was obtained in the range of 0.071 6～0.644 4 μg r=0.999 6(n=6).the average recovery was 99.99% and rsd=1.61%(n=6). conclusionthis method is easy, sensitive and accurate for the determination of chlorogenic acid in the extract of flos lonicerae.
key wordschlorogenic acid; hplc; determination
金银花flos lonicerae又名忍冬、双花 ，为临床常用中药 ,具有清热解毒、凉散风热之功效 ，主治痈肿疔疮、喉痹、丹毒、热毒血痢、风热感冒、温病发热等［1］。在中成药中，金银花或以细粉直接入药，或以提取物的形式入药，但大部分制剂以后者的形式入药，但即使以后者入药，也有两种形式，一是以全草直接投料,煎煮入药，即以煎煮液(即药材的提取液)作为半成品(中间体)；另一种是先提取有效部位，而后以提取物投料，即以提取物作为中间体(原料)（刘艳娥《第二军医大学硕士学位论文》）。为了有效控制金银花提取物（中间体）的内在质量，本实验参考了有关文献［2，3］及2005版《中国药典》［4］方法，采用高效液相色谱法测定金银花提取物中绿原酸含量。
1 仪器与试药
agilent 1100 series 高效液相色谱仪（g1322a排气阀，g1311a泵，g1316a柱温箱，g1314a紫外检测器），chemistation 色谱工作站，kromasil c18色谱柱，超声提取器（kq3200de型数控超声仪昆山市超声仪器有限公司）；绿原酸对照品(中国药品生物制品鉴定所，批号110753-200212)，金银花提取物（本实验室自制）， 乙腈，磷酸均为分析纯；水为双蒸水。
2 方法与结果［5］
2.1 分析方法的建立——分离及检测条件的选择
2.1.1 色谱条件 色谱柱为国产kromasil c18柱（250 mm×4.6 mm，7 μm）； 柱温25℃; 流动相为乙腈-0.4% 磷酸(12∶88)；流速为1 ml·min-1；检测波长327 nm。
2.1.2 ph值对峰形的影响 绿原酸属于有机酸类物质，在hplc测定时易发生前沿或拖尾峰，流动相加入酸可以改善这种现象。本实验比较了水、乙酸、磷酸对峰形的影响，当选用0.4%磷酸时，可得到较好的色谱峰形。
2.1.3 色谱系统适应性实验 在选定条件下，绿原酸和样品中其他组分可基线分离，绿原酸与其相邻色谱峰的分离度大于1.5，理论塔板数（n）为5 000以上。结果见图1。
a-对照品 b-供试品
图1 金银花提取物hplc图谱
2.2 对照品溶液的制备 精密称取绿原酸对照品适量，置棕色量瓶中，加50%甲醇制成每毫升含35.8μg的溶液，即得。2.3 供试品溶液的制备 精密称取本提取物10 mg，置100 ml容量瓶中，双蒸水溶解，超声2 min后，再用双蒸水定容至刻度，摇匀，过0.45 μg微孔滤膜，取续滤液即得。
2.4 线性范围的考察及其标准曲线的绘制 精密吸取对照品溶液2， 4，6，10，14，18μl，分别注入液相色谱仪。按上述色谱条件测定峰面积。以峰面积积分值（a）对进样量进行回归，得回归曲线方程：y =2 468.4x - 16.205，r=0.999 6。结果表明，绿原酸在0.071 6～0.644 4 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。结果见图2。
图2 绿原酸（上禾生物）标准曲线
2.5 精密度实验 精密吸取对照品溶液10μl，按上述色谱条件重复进样6次，记录各组绿原酸峰面积值，结果平均峰面积为：840.5，rsd为0.69%（n=6）。
2.6 稳定性实验 取同一供试品溶液，分别于0，2，4，6，8 h进样10μl，测得绿原酸的平均峰面积值为：680.24，rsd为：0.38%（n=5），表明供试品溶液在8 h内稳定。
2.7 重复性实验 取同一批号（070204）样品6份，按含量测定方法测定，结果绿原酸平均含量为28.01%，rsd为1.07%（n=6）。
2.8 加样回收率实验 精密称取已知含量的金银花提取物6份，分别精密添加绿原酸对照品适量，按供试品溶液的方法制备，测定，计算回收率。结果见表1。表1 加样回收率实验结果
2.9 样品测定 取3批样品，按照上述方法制备供试品溶液，进样10μl，依照已确定的色谱条件测定，按峰面积值用外标法计算样品中绿原酸的含量。结果见表2。表2 样品含量测定结果
3 讨论
金银花提取物（上禾生物）以有机酸为有效成分，本实验以绿原酸含量作为金银花提取物的质量控制指标，同时测定了3批金银花提取物中绿原酸的含量，通过计算，其含量均在20%以上。本文所建立的方法简便、快捷，重复性及稳定性均较好，可在实际生产中用于该提取物的质量控制。
金银花提取物绿原酸 5-98% 上禾生物 073184213302
以上资料 仅供参考
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