尽管FITC仍然是准备绿色荧光生物偶联物最受欢迎的荧光标记染料，但FITC存在某些局限性，例如显微镜成像时的严重光漂白和pH敏感的荧光。与FITC等荧光素衍生物相比，使用iFluor® 488染料制备的蛋白质偶联物要优越得多。iFluor® 488偶联物的亮度明显高于荧光素偶联物，并且更加光稳定。此外，iFluor® 488的荧光不受pH（4-10）的影响。这种pH不敏感性是相对于只在pH高于9时才发出最大荧光的荧光素的一个重要改进。iFluor® 488 SE染料相当稳定，并且显示出与蛋白质氨基基团的良好反应性和选择性。这种iFluor® 488的光谱特性和反应性与Alexa Fluor® 488 NHS酯（Alexa Fluor®是Invitrogen的商标）相似。

艾美捷iFluor 488琥珀酰亚胺酯：

货号 AAT-1023

分子量：945.07

溶剂：DMSO

校正因子（260纳米）：0.21

校正因子（280纳米）：0.11

消光系数（cm -1 M -1）：750001

激发（纳米）：491

发射（纳米）：516

量子产率：0.91

预期用途 仅供研究使用（RUO）

储存条件：冷冻（<-15°C）；尽量减少光照

库存溶液的准备：

除非另有说明，所有未使用的库存溶液应在制备后分成单次使用的小份，并储存在-20°C。避免反复冻融循环。

蛋白质库存溶液（溶液A）：

将100 µL的反应缓冲液（例如，1 M 碳酸钠溶液或pH约为8.5至9.0的1 M磷酸缓冲液）与900 µL的目标蛋白质溶液（例如，抗体，蛋白质浓度>2 mg/mL如果可能的话）混合，得到1 mL蛋白质标记库存溶液。

注意：蛋白质溶液（溶液A）的pH应为8.5 ± 0.5。如果蛋白质溶液的pH低于8.0，请使用1 M 碳酸钠溶液或1 M pH 9.0磷酸缓冲液将pH调整到8.0-9.0的范围。

注意：蛋白质应溶解在1X磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）中，pH 7.2-7.4。如果蛋白质是溶解在Tris或甘氨酸缓冲液中，必须对其进行透析，以对抗1X PBS，pH 7.2-7.4，以去除广泛用于蛋白质沉淀的游离胺或铵盐（如硫酸铵和醋酸铵）。

注意：不纯的抗体或用牛血清白蛋白（BSA）或明胶稳定的抗体将不会被很好地标记。亚硝酸钠或硫柳汞的存在也可能干扰偶联反应。亚硝酸钠或硫柳汞可以通过透析或旋转柱来去除，以获得最佳的标记结果。

注意：如果蛋白质浓度低于2 mg/mL，偶联效率将显著降低。建议最终蛋白质浓度范围为2-10 mg/mL，以获得最佳的标记效率。

iFluor® 488 SE库存溶液（溶液B）：

将无水DMSO加入iFluor® 488 SE瓶中，制成10 mM库存溶液。通过移液或涡旋混合均匀。

注意：在开始偶联之前准备染料库存溶液（溶液B）。请立即使用。染料库存溶液的长期储存可能会降低染料活性。溶液B可以在避光和防潮的情况下冷冻保存两周。避免冻融循环。

样品实验协议：

这个标记协议是为山羊抗小鼠IgG与iFluor® 488 SE的偶联而开发的。您可能需要为您特定的蛋白质进行进一步优化。

注意：每种蛋白质都需要不同的染料/蛋白质比例，这也取决于染料的性质。过度标记蛋白质可能会对其结合亲和力产生不利影响，而低染料/蛋白质比例的蛋白质偶联物则灵敏度降低。

运行偶联反应：

使用10:1的溶液B（染料）/溶液A（蛋白质）的摩尔比例作为起点：将5 µL的染料库存溶液（溶液B，假设染料库存溶液为10 mM）加入到蛋白质溶液（95 µL的溶液A）中，并有效摇动。假设蛋白质浓度为10 mg/mL，蛋白质的分子量约为200KD，则蛋白质的浓度约为0.05 mM。

注意：我们建议使用10:1的溶液B（染料）/溶液A（蛋白质）的摩尔比例。如果太低或太高，请分别确定5:1、15:1和20:1的最佳染料/蛋白质比例。

继续在室温下旋转或摇动反应混合物30-60分钟。

纯化偶联物：

以下是一个使用Sephadex G-25柱纯化染料-蛋白质偶联物的示例协议。

根据制造商的说明准备Sephadex G-25柱。

将反应混合物（来自“运行偶联反应”）加载到Sephadex G-25柱的顶部。

一旦样品运行到树脂表面顶部以下，立即加入PBS（pH 7.2-7.4）。

向所需的样品中加入更多的PBS（pH 7.2-7.4）以完成柱纯化。合并包含所需染料-蛋白质偶联物的分数。

注意：如果立即使用，染料-蛋白质偶联物必须用染色缓冲液稀释，并分装多次使用。

注意：对于长期储存，染料-蛋白质偶联物溶液需要浓缩或冷冻干燥。

表征所需的染料-蛋白质偶联物：

取代度（DOS）是表征染料标记蛋白质的最重要因素。较低DOS的蛋白质通常具有较弱的荧光强度，但较高DOS的蛋白质（例如，DOS>6）也倾向于荧光减少。对于大多数抗体，建议的最佳DOS在2到10之间，具体取决于染料和蛋白质的性质。为了有效的标记，应该控制取代度，使每摩尔抗体有6-8摩尔的iFluor® 488 SE。以下步骤用于确定iFluor® 488 SE标记蛋白质的DOS。

测量吸收：

要测量染料-蛋白质偶联物的吸收光谱，建议保持样品浓度在1-10 µM的范围内，具体取决于染料的消光系数。

在280 nm和染料最大吸收（λmax = 490 nm对于iFluor® 488染料）处读取OD（吸光度）

对于大多数分光光度计，需要将样品（来自柱分数）用去离子水稀释，以便O.D.值在0.1到0.9的范围内。280 nm处的O.D.（吸光度）是蛋白质的最大吸收，而490 nm是iFluor® 488 SE的最大吸收。为了获得准确的DOS，确保偶联物中不含未偶联的染料。

图：用iFluor 488抗人CD24*HI45*缀合物染色的PBMC的流式细胞术分析。在iFluor 488特异性B2-A通道中使用Aurora光谱流式细胞仪监测荧光信号。

https://www.amyjet.com/products/AAT-1023.shtml