活性氧（ROS）是细胞有氧代谢的天然副产物，在正常生理状态下参与细胞信号转导和稳态维持。然而，在氧化应激条件下，ROS水平显著升高，过量的ROS会损伤脂质、蛋白质和DNA，破坏细胞结构。氧化应激已被证实与心血管疾病、糖尿病、骨质疏松、脑卒中、炎症性疾病、神经退行性疾病及癌症等多种病理过程密切相关。因此，准确检测细胞内ROS水平，对于研究氧化应激调控机制及药物筛选具有重要意义。

由艾美捷代理的cayman推出的EZMeta™ 活性氧检测荧光分析试剂盒（货号：D-AKC1910）提供了一种简便、灵敏、快速的ROS检测方法。该试剂盒基于DCFH-DA荧光探针，适用于流式细胞术或荧光显微镜分析，可用于贴壁细胞和悬浮细胞中ROS水平的半定量测定。

检测原理

DCFH-DA（2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯）是一种可穿透细胞膜的荧光探针。该探针本身无荧光，进入活细胞后，被细胞内的酯酶水解生成DCFH（二氯二氢荧光素）。DCFH不能穿透细胞膜，因而滞留在细胞内。在细胞内ROS（包括过氧化氢、羟自由基、过氧亚硝酸盐等）存在下，DCFH被氧化生成具有强烈绿色荧光的DCF（二氯荧光素）。通过流式细胞仪或荧光显微镜检测DCF的荧光强度（激发/发射波长约为488 nm/525 nm），即可间接反映细胞内的ROS水平。荧光强度越强，表明ROS含量越高。

产品基本信息

项目 详细信息

货号 D-AKC1910

规格 50T / 100T

储存条件 -20°C避光保存，有效期12个月

适用样本 细胞（贴壁细胞和悬浮细胞）

所需但未提供的材料

流式细胞仪或荧光显微镜（配备488 nm激发光源及525 nm发射滤光片）

无血清培养基

37°C二氧化碳细胞培养箱

离心管

精密移液器及一次性吸头

过氧化氢（H₂O₂，用于阳性对照）

6孔板或其他适宜细胞培养板

实验步骤：先诱导后加载探针方案

根据刺激时间长短，本试剂盒推荐两种操作策略：

短时刺激（通常<2小时）：建议先加载探针，再用ROS阳性对照或待测药物刺激细胞。

长时刺激（通常>6小时）：建议先用药物刺激细胞，再加载探针。

以下为后一种方法（先诱导后加载探针） 的详细步骤，适用于长时间药物处理或需避免探针在长时间孵育中产生光漂白的实验。本方案以贴壁细胞为例。

1. 细胞准备

检测前一天将细胞接种于培养板中，确保检测时细胞密度低于5×10⁵ cells/mL。适宜的细胞密度有助于探针均匀负载和荧光信号的稳定。

2. 药物诱导

弃去细胞培养上清，加入用无血清培养基稀释的待测药物（或阳性对照），37°C细胞培养箱中避光孵育。实际诱导时间需根据药物特性和细胞类型进行优化。

3. 阳性对照处理（可选）

阳性对照孔：用无血清培养基将H₂O₂从100 mM稀释至工作浓度100 μM。加入细胞中，37°C避光孵育30分钟至4小时。不同细胞类型达到最佳ROS诱导效果的时间不同，例如HeLa细胞通常需要处理30–60分钟。

> 注意：阳性对照仅用于阳性对照孔，其余实验组无需添加。

4. ROS探针工作液配制

用无血清培养基稀释DCFH-DA储备液，使终浓度为10 μM。根据实验所需的孔数计算总体积，现配现用。

5. 探针加载

弃去含有药物或阳性对照的处理液。

用无血清培养基清洗细胞1–2次，以去除残留药物。

加入适量稀释好的DCFH-DA工作液，确保工作液完全覆盖细胞层。推荐体积：6孔板每孔不少于1 mL，96孔板每孔不少于100 μL。

37°C细胞培养箱中避光孵育30分钟。

6. 清洗与检测

弃去DCFH-DA工作液。

用无血清培养基清洗细胞1–2次，以去除未进入细胞的残余探针。

加入适量无血清培养基或PBS覆盖细胞。

立即使用流式细胞仪或荧光显微镜进行检测。

流式细胞术检测：收集细胞（贴壁细胞需先消化重悬），使用488 nm激发光，检测525 nm附近发射光（通常为FL1通道）。每样本至少收集10,000个细胞，计算平均荧光强度。

荧光显微镜检测：直接在培养板或爬片上观察，使用488 nm激发滤光片和525 nm发射滤光片。拍照时保持曝光参数一致，便于半定量比较。

实验设计建议

实验分组 处理方式 作用

空白对照 不加探针，仅加培养基 背景荧光扣除

阴性对照 加DCFH-DA探针，不加刺激剂 细胞基础ROS水平

阳性对照 加DCFH-DA探针 + 100 μM H₂O₂ 验证体系有效性，确定最大响应

待测药物组 加DCFH-DA探针 + 不同浓度药物 评估药物诱导或抑制ROS的能力

抗氧化对照组（可选） 预先用NAC等抗氧化剂处理，再加刺激剂 验证信号来源于ROS

注意事项

1. 避光操作：DCFH-DA探针和加载后的细胞均需严格避光，防止探针提前氧化或光漂白。

2. 无血清条件：探针稀释和细胞清洗均使用无血清培养基，因为血清中的酯酶可能降解探针或增加背景。

3. 阳性对照优化：H₂O₂的最佳处理时间和浓度需根据细胞类型预实验确定。处理时间过长或浓度过高可能导致细胞脱落或死亡，影响结果。

4. 贴壁细胞消化：若使用流式细胞术检测贴壁细胞，探针加载和清洗后需用不含EDTA的胰酶消化（EDTA可能影响细胞活力或荧光），消化后立即中和并上机检测。

5. 悬浮细胞处理：悬浮细胞可在离心管中进行药物诱导和探针加载，每次离心后轻柔重悬，避免细胞损伤。清洗步骤可适当增加离心力（如300g，5分钟）。

6. 时间一致性：从探针加载完成到检测之间的时间应尽可能保持一致，以排除探针自发氧化的影响。

产品优势总结

操作简便：无需裂解细胞，活细胞直接染色，兼容流式细胞术和荧光显微镜。

灵敏度高：DCFH-DA探针对多种ROS（H₂O₂、·OH、ONOO⁻等）均有响应，荧光信号与ROS浓度呈良好线性关系。

快速检测：探针加载仅需30分钟，总实验时间可控制在2–4小时内。

灵活适配：提供两种操作策略（先加探针或先加药），满足不同药物作用时长需求。

长期稳定：试剂盒在-20°C避光条件下可保存12个月。