脂质过氧化是一种多种脂质分子的非酶促氧化过程，涉及从碳原子上抽取氢原子并在通常与双键相邻的碳原子上插入氧分子。这会破坏脂质分子，导致如丙二醛（MDA）或4-羟基壬烯醛（HNE）等产物的形成。这些终产物可能作为信号分子发挥作用。检测脂质过氧化终产物是衡量病理生理过程中氧化损伤的有用指标。AkrivisBio的脂质过氧化检测提供了一种高效工具，通过与硫代巴比妥酸反应检测MDA，生成在532 nm处有吸收或荧光（激发/发射 = 532/553 nm）的生色团。

艾美捷脂质过氧化检测试剂盒：

货号：MA-0102

规格：100孔

样本类型：细胞或组织裂解液

适用范围：所有物种

检测方法：比色法，OD 532 nm；或荧光法，激发/发射 = 532/553 nm

检测类型：定量

应用：基于微孔板的比色/荧光检测，用于测定样本中的丙二醛（MDA）水平。

灵敏度：> 0.1 nmol/孔

储存条件：+4°C

运输温度：凝胶冰袋

有效期：自发货日期起一年

脂质过氧化检测试剂盒检测原理：

1. 破碎组织或细胞，沉淀蛋白。使用澄清的上清液进行分析。

2. 加入硫代巴比妥酸，在95°C孵育60分钟以形成生色团。

脂质过氧化检测试剂盒组成：

检测缓冲液：25 ml（WM MA-0102-A）

磷钨酸溶液：12.5 ml（NM MA-0102-B）

BHT：1 ml（紫色，MA-0102-C）

硫代巴比妥酸（TBA）：4 x 250 mg（NM MA-0102-D）

MDA标准品：100 ul（黄色，MA-0102-E）

用户自备试剂和设备：

冰醋酸

具有透明平底的96孔板

烤箱或热板

酶标仪

Eppendorf管或类似容器

储存和操作：

将试剂盒储存于4°C。使用前将所有试剂恢复至室温。打开前短暂离心试剂瓶。在进行检测前，请仔细阅读整个操作步骤。进行荧光检测时，请使用黑色或白色板。

试剂配制：

向一管硫代巴比妥酸中加入7.5 ml冰醋酸（用户自备），混合均匀。将浆液转移到另一管中，并加去离子水至最终体积25 ml。充分混合以溶解。如有必要，可超声以助溶解。配制好的溶液可在4°C下保存长达1周。

检测步骤：

1. 样本准备：

将10 mg组织或1×10⁶细胞在冰上用300 ul MDA裂解缓冲液+3 ul BHT进行匀浆。离心（13,000 X g，3-5分钟）以沉淀不溶性物质。或者，将样本在150 ul去离子水+3 ul BHT中匀浆以沉淀蛋白。加入150 ul 2 N高氯酸，涡旋，离心以去除蛋白。将200 ul上清液转移到微量离心管中。

对于血浆：在微量离心管中将20 ul血浆与500 ul 42 mM H₂SO₄（用户自备）混合。加入125 ul磷钨酸溶液，涡旋。静置5分钟，然后以13,000 x g离心1分钟。收集沉淀，并在冰上用100 ul去离子水+2 ul BHT重悬。用去离子水调整最终体积至200 ul。

2. 标准曲线准备：

用407 ul去离子水稀释10 ul MDA标准品，制备0.1 M MDA溶液。用980 ul去离子水稀释20 ul 0.1 M MDA溶液，制备2 mM MDA标准品。对于比色分析，将0、2、4、6、8、10 ul 2 mM MDA标准品分别加入不同的微量离心管中，并用去离子水调整体积至200 ul。对于荧光分析，将2 mM MDA标准品稀释10倍（10 ul + 90 ul去离子水）。将0、2、4、6、8、10 ul 0.2 mM MDA标准品分别加入不同的微量离心管中，并用去离子水调整体积至200 ul。

3. 显色反应：

向含有标准品或样本的每个试管中加入600 ul TBA试剂。在95°C下孵育60分钟以完成显色反应。在冰浴中冷却至室温10分钟。从每个反应混合物中取200 ul加入96孔微孔板进行分析。标准曲线范围：比色法：0 5 nmol；荧光法：0 0.5 nmol MDA。对于血浆：与300 ul正丁醇和100 ul 5 M NaCl混合；涡旋；离心（3分钟，16,000g，室温）；将正丁醇（上层）转移到新的离心管中，并使用热（55°C）和/或真空蒸发正丁醇。将剩余物质在200 ul去离子水中重悬。充分混合后，加入200 ul至96孔黑色板中。

偶尔，样本会出现浑浊，可以使用0.2 um滤膜去除。TBA会与样本中的其他化合物反应生成其他有色化合物。这些化合物通常不会干扰TBA-MDA加合物的定量。

注意：为了提高灵敏度，向800 ul反应混合物中加入300 ul正丁醇（用户自备），以提取生色团。如果没有分层，加入100 ul 5 M NaCl并剧烈涡旋。通过离心（3分钟，16,000g，室温）分离各层。转移并蒸发正丁醇，将生色团溶解在200 ul去离子水中，然后在96孔微孔板中读取。

4. 测量：

对于比色分析，读取532 nm处的吸光度。

对于荧光分析，使用激发/发射 = 532/553 nm读取上清液。

5. 计算：

从所有读数中减去0 MDA标准品的值。绘制MDA标准曲线。斜率定义了OD/nmol。将斜率应用于背景校正后的样本读数。对样本值进行校正，以考虑样本制备过程中进行的任何其他稀释。

样本羟脯氨酸浓度 = [(A/(mg或ml)] x 4 x D = nmol/ml或nmol/mg

其中：A：从标准曲线上得到的样本中MDA的量（以nmol计）。

mg：使用的原始组织量

ml：使用的原始血浆体积

4：使用800 ul反应混合物中的200 ul进行校正

D：稀释因子（用于准备原始样本）

https://www.amyjet.com/products/MA-0102.shtml