在生命科学研究的广阔领域中，解析基因对蛋白质功能的调控机制及蛋白质间的相互作用网络是揭开生命活动本质的核心环节。酵母单杂交（Yeast One-Hybrid, Y1H）、酵母双杂交（Yeast Two-Hybrid, Y2H）及酵母三杂交（Yeast Three-Hybrid, Y3H）系统作为该领域的经典研究工具，共同构成了解析基因调控与生物分子互作的“利器组合”。

       酵母杂交技术的原理大多基于GAL4转录激活机制，GAL4作为一种酵母转录因子，其核心功能是激活下游基因的转录过程。GAL4结构上包含两个关键功能域：一是位于N端1-147位氨基酸残基区段的DNA结合域（DNA binding domain，BD），二是位于C端768-881位氨基酸残基区段的转录激活域（Activation domain，AD）。其中，BD能够特异性识别并结合基因上游的激活序列UAS（Upstream-activating sequence）；而AD的作用则是启动UAS下游基因的转录。值得注意的是，BD与AD单独存在时无法激活转录反应，只有当二者在空间上实现充分接近并形成功能复合体时，才能共同激活UAS下游的启动子，进而促使启动子下游的目标基因发生转录。

图1 转录因子GAL4

       麦克林提供各类实验用酵母杂交试剂，具有纯度等级高、生产工艺先进、支持研发定制等特点，能被广泛适用于各类科研项目、研究实验中，欢迎选购。

       本文通过以下几点介绍麦克林酵母杂交试剂的化学特性和相关应用：

        1. 酵母双杂交系统工作原理

        2. 酵母单杂交系统工作原理

        3. 酵母三杂交系统工作原理

        4. 麦克林酵母杂交试剂产品介绍

1. 酵母双杂交系统工作原理

       酵母双杂交技术是解析蛋白质互作的核心工具，根据靶标蛋白特性分为两大关键系统 —核系统与膜系统。

       核系统的工作原理主要基于GAL4的AD与BD作用特性。如图2a所示，将目标蛋白A、B的基因分别克隆至BD、AD载体上，通过酵母细胞转化技术将构建好的载体DNA-BD、DNA-AD转化至酵母细胞中，使酵母细胞表达 A-BD 和 B-AD 融合蛋白。若 A 与 B 蛋白存在相互作用，二者在空间上会充分接近并形成功能复合体，可以重构 GAL4 的完整转录激活功能，进而激活下游报告基因（如HIS3、ADE2等）的表达，最终通过观察缺陷型培养基上酵母细胞的生长情况或显色反应，确定A、B蛋白是否存在相互作用。

       在膜系统酵母双杂交体系中，由76个氨基酸残基组成的泛素蛋白发挥着重要作用。如图2b所示，高度保守的泛素被拆分为 C 端 Cub（融合转录因子 TF）和 N 端 NubG 两个无独立功能的片段，将蛋白A、B的基因分别克隆到Cub与Nub的表达载体上，并将构建好的载体转化至酵母细胞，使酵母细胞分别表达出A-Cub-TF、B-NubG融合蛋白。当蛋白A与B在细胞膜上发生相互作用时，会牵引Cub与NubG空间上靠近并重构为完整泛素，泛素被泛素特异性蛋白酶（USP）识别剪切并释放TF，TF进入细胞核后激活报告基因的表达，从而使得该系统可以通过使用缺素培养基以及菌株是否变蓝进行阳性互作的筛选。

图2 酵母双杂交原理

2. 酵母单杂交系统工作原理

       酵母单杂交系统（Yeast One-Hybrid, Y1H）是在酵母双杂交技术基础上发展而来的，与酵母双杂交相比，其核心差异在于不依赖 DNA 结合域（BD）的参与，是一种用于研究蛋白质与特定 DNA 序列相互作用的技术。

       在 Y1H 实验体系中，将目标 DNA 序列（Bait，启动子或增强子片段）整合至酵母细胞的报告基因上游区域；同时，候选蛋白A与激活结构域（AD）融合后，在酵母细胞内表达出A-AD融合蛋白。若候选蛋白质与目标 DNA 序列发生特异性结合，便会激活报告基因表达，最终通过观察缺陷型培养养上酵母细胞的生长情况或显色反应，确定DNA与蛋白间是否存在特异性结合。

图3 酵母单杂交原理

3. 酵母三杂交系统工作原理

       酵母三杂交系统在酵母双杂交系统的基础上，引入了能够同时插入两个外源蛋白的pBridge质粒。实验时将蛋白A与蛋白Bait X的基因同时构建到pBridge质粒上，蛋白B基因构建到AD质粒上，通过酵母细胞转化技术将构建好的质粒转化至酵母细胞中，通过缺陷型平板上酵母细胞的生长状态反映Bait X蛋白对其他两种蛋白质的作用方式。

        酵母三杂交可变性很强，Bait X可以通过多种方式参与互作：

        a)  若蛋白 A 与蛋白 B 不直接相互作用，Bait X 可作为 “桥梁” 促进二者互作（如图 4a）；

        b)  通过修饰其中一个蛋白，使原本不直接互作的 A、B 产生相互作用（如图 4b）；

        c)  蛋白 A 与蛋白 B 可直接相互作用，Bait X 则可能发挥抑制作用，导致二者的互作减弱甚至完全终止（如图 4c）。

图4 酵母三杂交原理

4. 麦克林酵母杂交试剂产品介绍

       麦克林酵母杂交产品线秉持“精准、高效、便捷”的核心定位，深度聚焦科研场景中的实际需求，包含酵母培养基、 DO Supplement 系列氨基酸缺失混合物、酵母感受态制备及转化试剂等，旨在为科研人员提供从载体构建、菌株培养到筛选验证的一站式实验工具。

       借助麦克林 DO Supplement 系列氨基酸缺失混合物构建营养缺陷筛选体系，并结合其酵母转染试剂保障载体高效导入，对 Protein A 与 Protein B 的互作关系进行验证。如图5所示，通过阴性对照（AD+BD、AD-Protein A+BD、AD+BD-Protein B）排除空载体互作和蛋白自身激活后，AD-Protein A 与 BD-Protein B 的组合在 SD/LTAH 平板上生长，证明Protein A 和 Protein B 存在相互作用。

图5 麦克林酵母双杂交实测图

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