柠檬酸合酶(CS)测定试剂盒/微量法/48样
测定意义:
CS(EC 2.3.3.1 )广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体基质中,是三羧酸循环第一个限速酶,是三羧酸循环主要调控位点之一。
测定原理:
CS 催化乙酰 CoA 和草酰乙酸产生柠檬酰辅酶 A ,进一步水解产生柠檬酸;该反应促使无色的 DTNB 转变成黄色的 TNB,在 412nm 处有特征吸光值。
自备仪器和用品:
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰、无水乙醇和蒸馏水。
测定步骤:
1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 412nm,蒸馏水调零。
2、样本测定
(1)在试剂五中加入 0.6mL 无水乙醇和 13mL 试剂四,混匀,37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)孵育 5min;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
(2)测定管:在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10 μ L 样本、220 μ L 试剂五和 10 μ L 试剂六,混匀, 37℃反应 15min 后立即测定吸光值 A1。
(3)对照管:在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10 μ L 样本、220 μ L 试剂四和 10 μ L 试剂六,混匀, 37℃反应 15min 后立即测定吸光值 A2 。
(4)计算 ΔA=A1-A2,每个测定管设一个对照管。
注 意:
正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定。
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