检测目标
靶基因：
tox基因（编码白喉毒素，毒力标志，覆盖A/B亚型）
rpoB基因（种特异性标记，区分产毒与非产毒株）
覆盖菌株：包括流行株（如gravis/mitis/intermedius生物型）及疫苗株（如PW8株）。
方法原理
双重荧光PCR：
tox-FAM探针（毒力检测） + rpoB-HEX探针（菌种确认），内标（Cy5标记人GAPDH基因）监控采样质量。
采用抗抑制剂聚合酶，适配咽拭子、假膜组织等高蛋白样本。
适用样本
临床：咽拭子（假膜边缘）、鼻拭子、伤口分泌物
公卫监测：无症状携带者筛查、疫苗接种效果评估
二、试剂盒组分与操作流程
1. 核心组分
组分 功能说明
PCR预混液 含热启动Taq酶、dUTP/UNG防污染系统（防扩增产物残留）
探针引物混合液 tox-FAM/rpoB-HEX探针，内标（Cy5）
阳性对照 灭活产毒株NCTC 10648（tox+）与非产毒株NCTC 10356（tox-）混合DNA
核酸释放剂 含溶菌酶和蛋白酶K，支持拭子直接裂解（15分钟完成前处理）
2. 操作步骤（以咽拭子为例）
样本处理：拭子浸入300μL释放剂，95℃加热5分钟灭活。
PCR扩增（25μL体系）：
95℃ 5min → [95℃ 10s → 60℃ 30s]×40 cycles（FAM/HEX/Cy5同步采集）
结果判读：
tox（FAM）Ct≤35 + rpoB（HEX）Ct≤35 → 产毒株感染；
仅rpoB阳性 → 非产毒定植株。
三、性能与质控
1. 关键参数
指标 性能标准 验证依据
灵敏度 10拷贝/反应（纯DNA） WHO白喉核酸标准品
特异性 不与溃疡棒杆菌、假结核棒杆菌交叉 150例临床分离株验证
抗干扰性 耐受20%血液或30%黏液 模拟临床样本测试
2. 质控要求
每批次检测需包含：
阳性对照（tox+/tox-双控）
阴性对照（无菌PBS）
内标（Cy5 Ct值25-30）
四、注意事项
采样规范
假膜边缘采样检出率最高，避免触碰舌苔（可能含PCR抑制剂）。
生物安全
产毒株需BSL-2实验室操作，废弃物需121℃高压灭菌30分钟。
局限性
不能区分活动性感染与既往感染（需结合ELISA检测抗毒素抗体）。
五、应用场景
临床诊断：
急性喉炎伴灰白色假膜的快速鉴别（区别于链球菌/EB病毒感染）。
疫情处置：
暴发调查中无症状携带者筛查（如学校聚集性病例）。
疫苗研究：
疫苗株（如DTaP）免疫后的毒株替换监测。
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