该类试剂盒通常采用实时荧光定量 RT-PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）技术。
核心原理：TaqMan 荧光探针法。
靶基因：针对 N4 亚型流感病毒基因组中神经氨酸酶（NA）的保守区域设计特异性引物和探针。
检测过程：
逆转录（RT）：将样本中的病毒 RNA 反转录成 cDNA。
PCR 扩增：利用特异性引物对 cDNA 进行扩增。
荧光检测：探针结合到扩增产物上，随着扩增进行，探针被切断释放荧光信号。仪器实时监测荧光强度，从而判断样本中是否含有 N4 亚型病毒核酸。
2. 试剂盒组成 (典型配置)
一个标准的 48 人份/盒（或 48 次反应/盒）的试剂盒通常包含以下组分：
组分名称 规格 (示例) 作用 保存条件
PCR 反应液 500 μL (2×) 含 dNTPs、Mg2、缓冲液 -20℃
酶混合液 50 μL 含逆转录酶、Taq DNA 聚合酶 -20℃
N4 特异性引物/探针混合液 50 μL 识别 N4 亚型特异序列 -20℃
阳性对照 50 μL 含 N4 靶基因片段的质粒 (高浓度) -20℃
阴性对照 100 μL 无菌水或缓冲液 2-8℃或-20℃
内标 (Internal Control, IS) 50 μL 用于监控提取和扩增过程是否正常 -20℃
3. 适用样本与操作流程
适用样本类型：
禽类样本：鸭、鹅、鸡等禽类的咽喉拭子、泄殖腔拭子。
组织样本：病死禽的肺脏、脾脏、脑组织等。
环境样本：活禽交易市场的污水、笼具涂抹液。
操作流程详解：
第一步：样本采集与处理
使用无菌棉拭子采集禽类咽喉或泄殖腔分泌物，放入含病毒保存液（VTM）的采样管中。
第二步：病毒 RNA 提取
使用病毒 RNA 提取试剂盒（如磁珠法或柱提法）从样本液中提取总 RNA。
注意：此步骤至关重要，需防止 RNA 酶降解。
第三步：PCR 反应体系配置 (20 μL 体系示例)
在冰上配制反应混合液：
2× qPCR Mix: 10 μL
引物/探针混合液: 1 μL
酶混合液: 0.4 - 1 μL
模板 RNA: 5 - 10 μL
无核酸酶水: 补足至 20 μL
第四步：上机扩增
仪器设置：荧光通道通常选择 FAM（用于检测病毒）和 VIC/HEX（用于检测内标）。
反应程序：
逆转录：42℃ - 50℃ (30-60 分钟)
预变性：95℃ (2-5 分钟)
循环扩增：95℃ 15秒 → 60℃ 30-60秒 (采集荧光)，进行 40-45 个循环。
第五步：结果判读
阳性 (+)：FAM 通道出现典型的“S”型扩增曲线，且 Ct 值 < 35（或根据说明书设定阈值）。
阴性 (-)：FAM 通道无扩增曲线，或 Ct 值 > 40。
内标 (IS)：VIC 通道必须有正常扩增曲线（Ct 值 < 35），表明样本提取和扩增过程无抑制物干扰，结果才有效。
4. 关键注意事项
防污染 (重中之重)：
PCR 实验室必须严格分区（试剂准备区、样本制备区、PCR 扩增区）。
阳性对照含有高浓度的病毒核酸片段，极易造成气溶胶污染，导致假阳性。操作时必须小心，加完样后立即密封离心。
试剂保存：
试剂盒通常需要 -20℃ 避光保存。
严禁反复冻融。反复冻融会降低酶的活性，导致灵敏度下降。
公司正在出售的产品