己糖激酶(HK)测定试剂盒/分光光度法/48样
测定意义:
HK(EC 2.7.1.1 )广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,是葡萄糖分解过程中的第一个关键酶,催化葡萄糖转化为 6-磷酸葡萄糖,6-磷酸葡萄糖是糖酵解和磷酸戊糖途径的交叉点。
测定原理:
HK 催化葡萄糖合成 6-磷酸葡萄糖,6-磷酸葡萄糖脱氢酶进一步催化 6-磷酸葡萄糖脱氢生成 NADPH, NADPH 在 340nm 有特征吸收峰。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL 石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。测定操作:
加样表
试剂名称(μL)
测定管
试剂一
400
试剂二
试剂三
80
试剂四
试剂五
40
试剂六
8
样本
30
将上述试剂按顺序加入 1 mL 石英比色皿中,立即混匀,加样本的同时开始计时,在 340 nm波长下记录 20秒时的初始吸光度 A1 和 5 分 20 秒时的吸光度 A2 ,计算 ΔA=A2-A1。
注 意:
1、为了减小操作误差,建议将试剂一、二、三、四、五按比例配成混合液,预热 10min,取 30μL 样本+8μL试剂六+1mL 混合液,混匀后按照上述步骤检测。
2、不同匀浆组织中 HK 活力不一样,做正式试验之前请做 1-2 只预试,若 ΔA>0.5 ,则说明组织活力太高,必须用提取液稀释成适当浓度匀浆上清液(计算公式中乘以相应稀释倍数),或缩短反应时间至 2min,使ΔA<0.5,以提高检测灵敏度。
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