Ca++Mg++ ——ATP酶测试盒 新品

Ca++Mg++ ——ATP酶测试盒

测定意义与原理

测定意义

Ca²⁺-Mg²⁺-ATP酶是存在于组织细胞及细胞器膜上的一种蛋白酶，可催化质膜内侧的ATP水解，释放能量驱动细胞内钙离子泵出细胞或泵入内质网腔中储存，以维持细胞内低浓度的游离Ca²⁺，其测定具有重要的临床和科研价值：临床诊断：诊断和监测心血管疾病、神经系统疾病、肌肉疾病等毒理学研究：评估环境毒物和药物对细胞钙稳态的影响生物学研究：了解细胞信号传导、细胞凋亡和肌肉收缩机制农业研究：研究植物抗逆机制和品质改良环境监测：评估水体和土壤微生物污染程度

测定原理

分光光度法/比色法

Ca²⁺-Mg²⁺-ATP酶催化ATP水解生成ADP和无机磷（Pi），通过测定无机磷的量来确定ATP酶活性高低。反应式如下： ATP→Ca2+−Mg2+−ATP酶ADP+PiATPCa2+−Mg2+−ATP酶ADP+Pi

ELISA法

采用双抗体夹心法ELISA技术：将捕获抗体包被于酶标板上，捕获样品及标准品中的待测物Ca-Mg-ATPase，孵育清洗后，再加入生物素标记的检测抗体进行孵育后清洗，形成捕获抗体-抗原-检测抗体免疫复合物，随后加入链霉亲和素偶联的辣根过氧化物酶进行孵育，待孵育结束后清洗，接着加入TMB显色液后，若样本中有待测物则显蓝色，则加入终止液停止反应。检测过程中游离的成分均被洗去，用酶标仪在450nm处测OD值，颜色的深浅和样品中的待测物的含量呈正比，通过绘制标准曲线计算出样本中Ca-Mg-ATPase的浓度。

试剂盒组成

分光光度法试剂盒

组分 规格 作用说明

提取液 液体100mL×1瓶 含Tris-HCl缓冲液（pH7.4），用于提取样本中的Ca²⁺-Mg²⁺-ATP酶

试剂一 液体6mL×1瓶 含ATP溶液，反应底物

试剂二 液体6mL×1瓶 含CaCl₂溶液，激活剂，用于提高酶活性

试剂三 液体6mL×1瓶 含MgCl₂溶液，激活剂，用于提高酶活性

试剂四 液体6mL×1瓶 含钼酸铵溶液，显色剂，用于检测无机磷

标准品 液体1mL×1支 含无机磷标准品，用于建立标准曲线

ELISA法试剂盒

组分 规格 作用说明

包被板 96孔×1块 预先包被Ca-Mg-ATPase捕获抗体

酶标试剂 液体6mL×1瓶 含HRP标记的检测抗体，用于检测Ca-Mg-ATPase

标准品 0.3mL×6管 含Ca-Mg-ATPase标准品（15.625pg~1000pg/mL）

样本稀释液 10mL×1瓶 用于稀释样本和标准品

显色剂A液 6mL×1瓶 含过氧化氢溶液

显色剂B液 6mL×1瓶 含TMB溶液

终止液 6mL×1瓶 含硫酸溶液

20倍浓缩洗涤液 20mL×1瓶 用于洗涤酶标板

自备仪器与试剂

必备仪器

分光光度法/比色法：可见光分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水

ELISA法：酶标仪（450nm检测通道）、96孔板、37℃恒温箱、洗板机、水平轨道微孔板振荡器

通用：低温离心机（≥8000g）、恒温水浴锅、可调式移液器、电子天平

必备耗材

离心管（1.5mL/10mL）、一次性吸头、研钵/组织匀浆器

自备试剂：蒸馏水/去离子水、生理盐水、三氯乙酸

样本前处理方法

动植物组织样本取样：称取约0.1-0.2g组织，用生理盐水洗净表面杂质，用滤纸吸干匀浆：按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例进行冰浴匀浆离心：8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测稀释：若ATP酶活性过高，用提取液稀释1-10倍后测定

细胞样本收集：收集1×10⁶细胞，加入1mL提取液破碎：冰浴超声波破碎（功率20%，超声3s，间隔10s，重复30次）离心：8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测

血清/血浆样本血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜，然后1000×g离心20分钟，取上清即可，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融血浆：用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内于2-8℃1000×g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融

测定操作步骤

分光光度法/比色法操作仪器预热：分光光度计预热30min以上，调节波长到660nm，用蒸馏水调零标准曲线绘制：

将标准品稀释成0、10、20、30、40、50μmol/L系列浓度

取100μL标准溶液于比色管中，加入100μL试剂一、100μL试剂二、100μL试剂三，混匀

37℃水浴反应30min，加入100μL试剂四，混匀

室温反应15min，测定660nm处吸光度，绘制标准曲线样品测定：

取100μL样品溶液，按标准曲线步骤操作，测定吸光度

根据标准曲线计算样品中Ca²⁺-Mg²⁺-ATP酶活性

ELISA法操作试剂准备：将试剂盒从冷藏环境中取出，室温平衡15-30分钟；将20×洗涤缓冲液用蒸馏水20倍稀释后备用标准品配置：从20ng/mL标准品(200μL)按需吸取一定量用1×稀释液稀释1000pg/mL(例:50μL的标准品母液+950μL的1×稀释液,制备得到1000μL的1000pg/mL浓度标准品),随后在6个试管中分别加入500μL的1×稀释液,在这6个单独的试管中1000pg/mL标准品依次2倍倍比稀释至6个梯度,共配制7个浓度的标准品,依次为:1000pg/mL、500pg/mL、250pg/mL、125pg/mL、62.5pg/mL、31.25pg/mL、15.625pg/mL,从最高浓度标准品溶液中吸取500μL标准品到下一个试管中,轻轻吹打混匀,以此类推进行标准品的倍比稀释,1×稀释液用作零浓度标准品(0pg/mL)加样：从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃；设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；空白孔不加温育：除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入HRP标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔；37℃水浴锅或恒温箱温育60min洗涤：弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）显色：每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min终止：每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值结果计算：绘制标准曲线，按曲线方程计算样本浓度

结果计算方法

单位定义

U/g 鲜重：每克鲜重样本每分钟催化生成1μmol无机磷的酶量

U/mg prot：每毫克组织蛋白每分钟催化生成1μmol无机磷的酶量

U/L：每升样本每分钟催化生成1μmol无机磷的酶量

pg/mL：每毫升样本中Ca-Mg-ATPase的含量（ELISA法）

分光光度法计算公式

Ca2+−Mg2+−ATP酶活性(U/g鲜重)=(A测定−A空白)×C标×V总(A标准−A空白)×W×TCa2+−Mg2+−ATP酶活性(U/g鲜重)=(A标准−A空白)×W×T(A测定−A空白)×C标×V总

A测定：样本管吸光度值

A空白：空白管吸光度值

A标准：标准管吸光度值

C标：标准品浓度（μmol/mL）

V总：样本提取液总体积（mL）

W：样本质量（g）

T：反应时间（min）

ELISA法计算公式

Ca-Mg-ATPase含量(pg/mL)=样本OD值−空白OD值标准品OD值−空白OD值×标准品浓度×稀释倍数Ca-Mg-ATPase含量(pg/mL)=标准品OD值−空白OD值样本OD值−空白OD值×标准品浓度×稀释倍数

性能指标

指标 分光光度法 ELISA法

线性范围 0~50μmol/L 15.625pg~1000pg/mL

最低检测限 ≤0.1μmol/L ≤7.81pg/mL

回收率 90%~110% 90%~110%

批内精密度 CV≤5.0% CV≤10%

批间精密度 CV≤8.0% CV≤15%

稳定性 2-8℃保存12个月 2-8℃保存6个月

注意事项

样本处理：

样本需新鲜制备，避免酶失活；-20℃可保存3个月

组织样本需冰浴匀浆，避免酶失活

液体样本需避免溶血和细菌污染，溶血标本不宜进行此项检测

试剂使用：

不同批号试剂不能混用，需重新绘制标准曲线

TMB显色液需避光保存，避免失效

ELISA法试剂需避免反复冻融，用后立即放回2-8℃保存

测定过程：

分光光度法反应温度需严格控制在37℃，反应时间30分钟

ELISA法需严格控制温育时间和温度，避免影响显色反应

若吸光度值超出线性范围，需稀释样本后重新测定

质量控制：

每次实验需设置空白对照和质控样本

定期校准仪器，确保检测结果准确性

若结果偏差较大，需检查试剂是否变质或样本处理是否正确

其他注意事项：

终止液为稀硫酸溶液，具有一定腐蚀性，应谨慎操作

某些成分含有防腐剂，可能会引起皮肤过敏反应，应佩带口罩避免吸入薄雾

显色剂B可能会引起皮肤、眼睛和呼吸道刺激，应佩带口罩避免吸入薄雾

佩戴防护手套、防护服、眼睛和面部防护用品，处理后彻底洗手

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