商品属性
产品名称 | 多酚氧化酶(PPO）测试盒 | 产品货号 | BH-961156 |
规格 | 100管/48样、50管/24样 | 产品分类 | 氧化与抗氧化系列 |
测试方法 | 微量法、可见分光光度法 | 用途 | 仅供科研实验 |
测定意义与原理
测定意义
多酚氧化酶（PPO，EC1.14.18.1）是一种含铜的氧化还原酶，在生物体内具有重要作用：植物抗逆性：参与植物对病原微生物入侵的防御反应，形成木质素增强细胞壁结构食品褐变：催化酚类物质氧化导致食品褐变，影响食品外观、风味和营养价值生物制药：可用于生产茶色素、黑色素等天然色素环境监测：作为生物指标评估环境污染对植物的影响
测定原理
采用邻苯二酚氧化法，PPO催化邻苯二酚氧化生成有色的醌类化合物，在420nm处有特征吸收峰，吸光度变化速率与PPO活性成正比。反应式如下： 邻苯二酚+O2→PPO醌类化合物+H2O邻苯二酚+O2PPO醌类化合物+H2O
试剂盒组成
组分 规格 作用说明
试剂一 25mL×1瓶/50mL×1瓶 含0.1mol/L磷酸缓冲液，pH6.5，用于反应体系构建
试剂二 10mL×1瓶/20mL×1瓶 含0.1mol/L邻苯二酚溶液，反应底物
试剂三 100mL×1瓶 含0.1mol/L磷酸缓冲液，pH7.4，用于样本提取
试剂四 1mL×1支/2mL×1支 含100U PPO标准品，用于建立标准曲线
提取辅助剂 液体10mL×1瓶 含0.1% Triton X-100，用于细胞膜破膜和酶提取
自备仪器与试剂
必备仪器
分光光度计/酶标仪（420nm检测通道）
低温离心机（≥8000g）
恒温水浴锅（控温精度±0.5℃）
可调式移液器（0.5-10μL、10-100μL、100-1000μL）
研钵/组织匀浆器（冰浴专用）
必备耗材
1mL玻璃比色皿/96孔板
离心管（1.5mL、10mL）
一次性无菌吸头
手术剪/镊子（用于组织样本处理）
自备试剂
蒸馏水/去离子水
生理盐水（0.85% NaCl）
液氮（可选，用于样本速冻）
样本前处理方法
动植物组织样本取新鲜组织，用生理盐水冲洗干净，滤纸吸干水分称取约0.1g组织，加入1mL预冷提取液（试剂三）+ 10μL提取辅助剂，冰浴匀浆8000g 4℃离心15min，取上清液置冰上待测若PPO活性过高，可用提取液稀释1-10倍后测定
细菌/细胞样本收集对数生长期细菌/细胞，8000g 4℃离心5min弃上清按照细菌或细胞数量(10⁴个):提取液体积(mL)=500~1000:1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液）+ 10μL提取辅助剂，冰浴超声波破碎细胞（功率20%或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）8000g 4℃离心15min，取上清液置冰上待测
食品/农产品样本水果/蔬菜：洗净切块，加入预冷提取液（1:5~10W/V），冰浴匀浆茶叶/咖啡豆：研碎后加入预冷提取液（1:20W/V），冰浴浸泡30min，过滤或离心取上清加工食品：固体食品磨碎后用提取液提取，液体食品直接离心取上清
测定操作步骤
分光光度法操作
试剂准备：
试剂一：液体25mL×1瓶，4℃保存
试剂二：液体10mL×1瓶，-20℃保存，用时加10mL蒸馏水溶解
试剂三：液体100mL×1瓶，4℃保存
工作液：试剂一 + 试剂二，按体积比10:1混合，现配现用
预温育：
分光光度计预热30min，调节波长到420nm，蒸馏水调零
工作液在37℃（哺乳动物）或25℃（植物）水浴中预热10min以上
反应启动：
取比色皿，依次加入工作液950μL + 样本50μL
立即混匀，记录420nm波长下0min（A1）和1min（A2）时的吸光度值
计算ΔA：ΔA = A2 - A1
微量法（酶标仪）操作96孔板每孔加入：工作液95μL + 样本5μL25℃预温育5min，加入样本后立即混匀设置动力学模式，420nm处连续读取10个循环（每1min读取1次）计算吸光度上升速率（ΔA/min）
酶活力计算方法
单位定义
U/g鲜重：每克组织鲜重每分钟催化1μmol邻苯二酚氧化的酶量
U/mL：每毫升样本每分钟催化1μmol邻苯二酚氧化的酶量
U/mgprot：每毫克蛋白每分钟催化1μmol邻苯二酚氧化的酶量
计算公式
PPO活性(U/mgprot)=ΔA×V反总×V样总ε×d×Cpr×V样测×TPPO活性(U/mgprot)=ε×d×Cpr×V样测×TΔA×V反总×V样总
ΔA：1min内吸光度变化值
V反总：反应体系总体积（1.0mL）
V样总：样本提取液总体积（mL）
ε：醌类产物摩尔消光系数（0.0037 L/(μmol·cm)）
d：比色皿光径（1cm）
Cpr：样本蛋白浓度（mg/mL）
V样测：测定时加入样本体积（0.05mL）
T：反应时间（1min）
简化公式
按鲜重计算：PPO（U/g鲜重）= 53.76 × ΔA ÷ W
按液体体积计算：PPO（U/mL）= 53.76 × ΔA
按蛋白含量计算：PPO（U/mgprot）= 53.76 × ΔA ÷ Cpr
性能指标
指标 要求
线性范围 0~50U/mL，线性相关系数r≥0.995
最低检测限 ≤0.1U/mL
回收率 90%~110%
批内精密度 CV≤5.0%
批间精密度 CV≤8.0%
稳定性 4℃保存12个月，活性保留≥90%
注意事项
样本处理：
样本需新鲜制备，PPO在低温下活性稳定，但反复冻融会导致活性下降
匀浆与超声破碎需在冰浴中进行，控制温度在0-4℃
样本提取后应立即测定，避免酶失活
试剂使用：
邻苯二酚溶液对光敏感，配制后需避光保存，一周内用完
不同批号试剂不能混用，需重新绘制标准曲线
工作液需现配现用，室温下放置时间不超过2小时
测定过程：
反应温度需严格控制：植物样本25℃，哺乳动物37℃
若ΔA值大于0.2，需稀释样本后重新测定
每个样本需设置至少3个平行实验，结果取平均值
质量控制：
每次实验需设置空白对照和质控样本
定期校准仪器，确保检测结果准确性
若结果偏差较大，需检查试剂是否变质或样本处理是否正确
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