本试剂盒采用间接法酶联免疫吸附试验原理,将纯化的军团菌抗原包被在酶标板微孔中,封闭非特异性结合位点后,加入待测样本,样本中存在的人军团菌IgA抗体会与微孔内的军团菌抗原发生特异性免疫结合,洗涤除去未结合的杂质,再加入辣根过氧化物酶标记的抗人IgA二抗,使其与样本结合的IgA抗体结合,经底物显色、终止反应后,通过检测吸光度值,依据标准曲线定量检测样本中军团菌抗体IgA的浓度。
基本参数:

产品名称:人军团菌抗体IgA(LP Ab-IgA)ELISA试剂盒
英文名称:LP Ab-IgA Elisa Kit
货号:Y-E596
规格:48T/96T
灵敏度:最低检出滴度 1:20
检测范围:阳性判定临界值 OD 0.18–2.8
反应时间:样本室温孵育 90min,洗板,酶结合物孵育 60min,显色 20min,终止读数,全程约 180min
保存条件:试剂盒整体 2~8℃保存,浓缩洗涤液室温避光存放即可,不可冷冻
显色系统:双组份 TMB 显色体系
检测波长:450nm 单波长检测
标准曲线绘制:设置阴阳性对照 + 梯度稀释阳性标准品,OD 值拟合线性曲线,大于临界值判定为 IgA 抗体阳性
注意事项:样本需新鲜分离血清,反复冻融样本易出现假阴性;每板必须设置阴阳对照孔;终止液具有腐蚀性,避免接触皮肤
通用注意事项:

样本要求
血清、血浆避免严重溶血、脂血、黄疸;组织匀浆充分离心去除沉淀;样本分装冻存,反复冻融≥3 次会导致抗原降解,检测值偏低。
温度控制
孵育温度严格 37℃,温箱温度波动、室温过低会降低结合效率,背景升高、重复性变差。
避光操作
TMB 底物、酶结合物、神经递质 / 维生素类靶标样本见光易氧化,显色全程避光,试剂避光存放。
洗板规范
洗涤不充分会造成高背景、假阳性;拍干时使用干净吸水纸,禁止交叉污染微孔。
污染防控
实验耗材无 DNase、RNase、蛋白酶;枪头一次性更换,标准品与样本避免交叉加样;底物液变色、出现沉淀不可使用。
安全防护
终止液含稀硫酸,具有腐蚀性,避免接触皮肤、黏膜;实验废液集中收集中和后处理,不可直接倾倒。
失效判定
试剂盒超出有效期、试剂浑浊变色、标准品梯度无明显颜色差异,均判定失效,禁止继续实验。
稀释校正
样本 OD 值高于最高标准孔时,必须稀释重测,最终结果乘以稀释倍数;低于最低检测限标注 “低于试剂盒灵敏度”。
空白对照
空白孔吸光度应极低,若空白孔 OD>0.1,说明洗涤不充分或试剂污染,实验作废重做。
储存禁忌
试剂盒不可冷冻结冰,冷冻会造成酶标抗体蛋白变性,直接导致试剂盒完全失效。
实验步骤如下:

样本预处理
采集静脉血分离血清,无溶血、无脂血、无黄疸样本可直接检测;浑浊血清经 8000r/min 离心 8min 取上层清液,短期 4℃存放不超 24h,长期保存分装 - 20℃冷冻。
试剂室温平衡
整套试剂盒所有组分室温放置 25min;浓缩洗涤液按说明书配比用纯水稀释混匀,配好的洗涤液室温存放,24h 内用完。
标准品配制加孔
军团菌 IgA 标准品用稀释液完全溶解,梯度稀释 7 个浓度梯度,标准品孔每孔添加稀释后标准品 50μL;阴性对照孔加阴性对照血清 50μL,空白孔空置备用。
一抗结合孵育
待测血清样本每孔加入 50μL,再加入辣根过氧化物酶标记抗人 IgA 抗体工作液 50μL,封板膜封板,37℃温箱孵育 45min。
多次洗板
弃去孔内反应液,每孔注满洗涤液,浸泡 40s 后倒扣拍干,连续洗板 4 次,每次彻底拍干微孔内液体,防止非特异性结合干扰结果。
避光显色
每孔加入底物显色混合液 100μL,轻轻晃动酶标板混匀,37℃避光条件下显色 12min,严格把控显色时长避免过曝。
终止检测
每孔加入终止液 50μL 终止反应,酶标仪 450nm 单波长读取 OD 值,对照标准曲线判定样本军团菌 IgA 抗体阳性 / 阴性及抗体浓度。
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