小鼠胚肺成纤维细胞

方法简介  实验室分离的小鼠胚肺成纤维细胞采用胰蛋白酶-胶原酶混合消化法结合差速贴壁法制备而来。

质量检测  实验室分离的小鼠胚肺成纤维细胞经Vimentin免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基：  小鼠胚肺成纤维细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 成纤维细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传3-5代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

小鼠胚肺成纤维细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：C57BL/6小鼠，取健康组织块约0.5-1g

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、DMEM/F12完全培养基、胎牛血清(FBS)

分离纯化步骤

取实验动物目标组织，用预冷无钙镁PBS反复冲洗去除血液和杂质

剪碎组织至1mm3大小，加入0.25%胰蛋白酶，37度消化30-40分钟

加入II型胶原酶继续消化30分钟，胎牛血清终止消化

经70um和40um滤网过滤，300g离心8分钟收集细胞沉淀

重悬细胞后接种于未包被培养皿中，37度培养24小时后换液去除悬浮细胞

原代培养要点

成纤维细胞贴壁能力强，接种后12-24小时大部分细胞贴壁，呈梭形或星形

使用DMEM/F12+10%FBS完全培养基，37度、5% CO2培养

每2-3天换液一次，细胞融合达80-90%时可用0.25%胰蛋白酶消化传代

原代成纤维细胞增殖较快，通常7-14天可达融合状态

常见问题优化

成纤维细胞生长过快：适当降低FBS浓度至5-10%可减缓生长速度

细胞老化：控制传代次数在10代以内，早期代次实验结果更可靠

交叉污染：严格无菌操作，注意区分成纤维细胞与肌成纤维细胞表型

复苏准备：胚肺成纤维细胞完全培养基、无菌 PBS、0.25% 胰酶‑EDTA 消化液 37℃水浴回温，超净台紫外灭菌 30min，准备 T25 培养瓶、15mL 离心管、无菌移液耗材，检查冻存管无破损渗漏。

冻存管水浴解冻：液氮取出冻存管，快速置于 37℃水浴，持续轻晃 1‑2min，大部分冰晶融化，残留微小冰屑即可取出，75% 酒精擦拭外壁，移入超净工作台。

稀释离心除冻存剂：无菌打开冻存管，细胞悬液缓慢滴加到装有 4mL 预热完全培养基的离心管，轻柔吹打混匀，1000r/min 离心 5min，沉降细胞，去除含 DMSO 的冻存上清。

重悬接种铺瓶：离心完毕弃上清，加入 2mL 胚肺成纤维细胞完全培养基，吹打重悬底部细胞沉淀，打散细胞团，悬液转移至 T25 培养瓶，补加培养基，多角度轻晃培养瓶，细胞均匀分布瓶底。

恒温箱静置孵育：培养瓶平稳放入 37℃、5% CO₂饱和湿度培养箱，静置孵育 24h，不随意挪动，利于成纤维细胞贴壁铺展。

换液镜检：24h 后取出，吸弃旧培养基，PBS 轻柔漂洗细胞层，清除悬浮死细胞碎片，更换预热新鲜完全培养基，放回培养箱，每日镜检梭形细胞形态，排查微生物污染。

传代处理：细胞汇合度 85‑90%，弃培养基，PBS 清洗细胞 2 次，加入胰酶消化液 37℃消化 2‑3min，镜下细胞回缩变圆，加入完全培养基终止消化，吹打收集细胞，离心，按 1:2‑1:3 比例分瓶传代。