人结肠成纤维细胞

人结肠成纤维细胞

以伦理批准的人源组织肠道组织为材料，采用组织块贴壁法结合酶消化分离成纤维细胞，经0.25%胰蛋白酶-EDTA消化后传代，使用DMEM/F12完全培养基维持细胞生长；利用Transwell模型结合ATAC-seq检测CD90, vimentin标志物表达，通过Western blot分析蛋白表达谱，并采用qRT-PCR在mRNA水平验证目标基因表达。

产品名称：人结肠成纤维细胞

英文名称： Human Colonic Fibroblasts

组织来源： 结肠组织

默认种属 ：人

产品规格：5×10^5Cells/T25

方法简介  实验室分离的人结肠成纤维细胞采用胶原酶-中性蛋白酶联合消化结合差速贴壁法，并通过专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的人结肠成纤维细胞经特异性标志物免疫荧光鉴定，纯度可达85%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： 鼠尾胶原Ⅰ（2-5 μg/cm²）

培养基： 人结肠成纤维细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 成纤维细胞样

传代比例： 1:3

传代特性： 可传5-8代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

人结肠成纤维细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

一、实验前准备

1. 手术剪、镊子、培养耗材高压灭菌；超净台紫外通风30min。

2. 配制灌洗液 冰预冷PBS缓冲液、消化液（EDTA+胰蛋白酶）+Ⅳ型胶原酶、DMEM/F12 + 10% FBS + 1% 双抗、双抗。

3. 人源组织样本（临床手术废弃组织），冰浴预冷所有缓冲液。

二、取材与预处理

1. 经伦理委员会批准获取，75%酒精浸泡消毒体表，无菌操作下暴露并摘取肠。

2. 置于冰预冷PBS缓冲液中反复漂洗，去除血污及附属组织，仔细剔除结缔组织。

3. 将纯化后的肠组织用眼科剪尽量剪碎，尽量减小组织块大小以利消化。

三、细胞分离与消化

1. 组织碎块与EDTA+胰蛋白酶+Ⅳ型胶原酶混合酶液按1:3比例混合，37℃振荡消化47min。

2. 加入含20% FBS的培养基中和酶活性，反复吹打使组织充分分散。

3. 细胞悬液经40μm滤网过滤，2次200g×10min离心洗涤，收集细胞。

四、纯化与接种培养

1. 细胞悬液经40μm滤网过滤，采用差速贴壁法去除杂质细胞，去除未消化组织块。

2. 用DMEM/F12 + 10% FBS + 1% 双抗调整细胞浓度至120000.0cells/mL，接种于预涂胶原的培养皿中。

3. 置于37℃、5% CO2培养箱中培养，每2-3天换液一次，倒置显微镜下观察细胞贴壁及长梭形或纺锤形，贴壁生长，细胞核大而圆，核仁明显。

实验用健康成人手术废弃组织(成人)经局部麻醉后处死，立即取结肠组织置于冰预冷的DMEM培养基中，2小时内完成后续分离操作。

培养器皿提前用0.1mg/ml纤连蛋白包被过夜，4°C保存，使用前用PBS洗涤2次，该处理可显著促进肠成纤维的贴壁生长。

该细胞贴壁生长，增殖较为缓慢，每3-4天换液一次，传代比例建议1:2至1:4，长期培养需注意细胞衰老标记物的检测。

培养基中应加入DMEM/F12含10% FBS和1%青霉素-链霉素，使用前需预热至37°C并预平衡CO2浓度至5%，血清批次更换前需进行预实验验证促生长效果。

换液操作全程注意无菌操作，使用经0.22μm滤膜过滤的新鲜培养基，加入后轻摇培养皿使培养基均匀分布，避免产生气泡影响细胞生长。