小鼠结肠成纤维细胞

方法简介  实验室分离的小鼠结肠成纤维细胞采用胶原酶-中性蛋白酶联合消化结合差速贴壁法，并通过专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的小鼠结肠成纤维细胞经特异性标志物免疫荧光鉴定，纯度可达85%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： 鼠尾胶原Ⅰ（2-5 μg/cm²）

培养基： 小鼠结肠成纤维细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 成纤维细胞样

传代比例： 1:3

传代特性： 可传5-8代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

小鼠结肠成纤维细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：5-7周龄ICR小鼠，体重18-24g，每只取材获0.35-0.75×10⁶个细胞，活力>86%

试剂：Dispase、Ⅳ型胶原酶、胰蛋白酶、Hanks液、DMEM/F12完全培养基

分离纯化步骤

组织取材后迅速放入预冷PBS中转运，无菌操作下剔除周围组织，剪碎后加入Dispase、Ⅳ型胶原酶、胰蛋白酶、Hanks液于37℃消化30-50分钟

消化产物经100目滤网过滤，PBS洗涤1次，400g离心10分钟收集细胞沉淀

采用预混合抗体标记+磁珠分选策略，特异性富集目标细胞，纯度>87%

原代培养要点

细胞重悬于完全培养基中，按3×10⁴密度接种，置于37℃、5% CO₂恒温培养箱

贴壁细胞生长呈接触抑制，融合度达80%时需及时传代，避免过度融合导致细胞老化

常见问题优化

纯度不达标：优化密度梯度离心条件，延长免疫磁珠孵育时间，增加洗涤步骤

细胞形态异常：检查培养基pH值和渗透压，避免过度传代导致细胞老化

细胞活力差：严格控制消化时间，除消化步骤外全程冰上操作，使用新鲜配制试剂

一、实验前准备

1. 准备无菌手术器械（手术剪、镊子、眼科剪）、培养耗材，高压灭菌后备用；超净工作台紫外消毒。

2. 提前配制冰预冷PBS液、消化液（EDTA、胰蛋白酶）、Ⅳ型胶原酶、DMEM/F12 + 10% FBS + 1% 双抗（37℃预热）、双抗溶液。

3. SPF级C57BL/6小鼠（18-22g），戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，所有试剂冰浴预冷备用。

二、取材与预处理

1. CO2吸入法处死，碘伏消毒术野，无菌操作取出肠组织。

2. 浸入冰预冷PBS液中冲洗干净，仔细分离去除血管、神经及结缔组织。

3. 将组织转移至新的培养皿中，用手术剪精细剪碎成细小碎块。

三、细胞分离与消化

1. 组织碎块加入EDTA+胰蛋白酶混合消化液，37℃消化39min，间断吹打。

2. 加入含10% FBS的培养基终止消化，吹打制备单细胞悬液。

3. 200g离心10min收集细胞沉淀，PBS重悬洗涤两遍。

四、纯化与接种培养

1. 细胞悬液过40μm细胞滤网，采用差速贴壁法去除杂质细胞，去除团块和未消化组织。

2. 沉淀细胞用DMEM/F12 + 10% FBS + 1% 双抗重悬，台盼蓝染色检测活力（应>90%），以60000.0-240000.0cells/cm²密度接种。

3. 放入37℃、5% CO2恒温培养箱，每2-3天换液一次，镜检观察长梭形或纺锤形，贴壁生长，细胞核大而圆，核仁明显及生长状态。