人脐带血造血干细胞

方法简介  实验室分离的人脐带血造血干细胞采用胶原酶-中性蛋白酶联合消化结合差速贴壁法，并通过专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的人脐带血造血干细胞经特异性标志物免疫荧光鉴定，纯度可达85%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： 鼠尾胶原Ⅰ（2-5 μg/cm²）

培养基： 人脐带血造血干细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 悬浮

细胞形态： 圆形

传代比例： -

传代特性： 不传代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

人脐带血造血干细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：健康志愿者供体组织（经医院伦理委员会批准），每例取材获0.8-2.5×10⁶个细胞，活力>90%

试剂：0.1%胰蛋白酶、Ⅰ型/Ⅳ型胶原酶混合液、DNase I、BSA、MEM/F12培养基

分离纯化步骤

抗凝血液经Ficoll-Hypaque梯度离心分离外周血单个核细胞（PBMCs），PBS洗涤后重悬

细胞悬液经200目滤网过滤去除组织碎片，400g离心10分钟收集细胞沉淀，PBS洗涤1次

经Percoll不连续密度梯度离心分离目标细胞层，PBS洗涤后收集

原代培养要点

调整细胞密度至5×10⁵ cells/mL接种，置于37℃、5% CO₂恒温培养箱中悬浮培养

细胞呈圆形悬浮生长，培养过程中注意观察细胞聚团情况，必要时轻轻摇匀

常见问题优化

目标细胞占比低：优化Ficoll梯度离心条件，改进密度梯度分离策略

细胞贴壁率低：免疫细胞本为悬浮生长，注意使用低吸附培养器皿

细胞活力差：操作全程保持低温，使用新鲜配制试剂，离心力不宜过高

一、实验前准备

1. 手术器械（剪刀、镊子、止血钳）及培养耗材经121℃高压灭菌20min；超净台紫外照射30min。

2. 配制冰预冷PBS缓冲液、胶原酶Ⅳ+透明质酸酶混合消化液、α-MEM + 10% FBS + 1% 双抗、胎牛血清、双抗，全部冰浴预冷。

3. 人源组织样本（临床手术废弃组织）处理。

二、取材与预处理

1. 经伦理委员会批准获取，体表酒精消毒，暴露目标组织器官。

2. 无菌条件下摘取胎盘组织，冰预冷PBS缓冲液漂洗去除血液及杂质，去除周围结缔组织和脂肪。

3. 眼科剪将组织剪碎至1mm³小块，转入离心管。

三、细胞分离与消化

1. 剪碎组织加入胶原酶Ⅳ消化液，37℃水浴消化36min，期间每隔5-10min振荡吹打。

2. 用含血清培养基终止反应，经200目筛网过滤获取单细胞悬液。

3. 4℃、200g离心10min，弃上清，PBS洗涤两次，重悬细胞沉淀。

四、纯化与接种培养

1. 细胞悬液经40μm滤膜过滤，采用Percoll密度梯度离心富集干细胞，去除大颗粒杂质。

2. 用α-MEM + 10% FBS + 1% 双抗重悬细胞沉淀，调整接种密度后接种至明胶预包被的培养器皿。

3. 37℃、5% CO2培养，每2天换液一次，定期倒置显微镜观察梭形或多角形，贴壁生长，核质比高，核仁明显及生长情况。