人骨髓造血干细胞

方法简介  实验室分离的人骨髓造血干细胞采用胶原酶-中性蛋白酶联合消化结合差速贴壁法，并通过专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的人骨髓造血干细胞经特异性标志物免疫荧光鉴定，纯度可达85%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： 鼠尾胶原Ⅰ（2-5 μg/cm²）

培养基： 人骨髓造血干细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 悬浮

细胞形态： 圆形

传代比例： -

传代特性： 不传代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

人骨髓造血干细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：成年患者（25-60岁）手术切除标本，经患者知情同意及伦理审批，单份组织可得0.5-2.0×10⁶个细胞，活率>88%

试剂：弹性蛋白酶、胰蛋白酶、EDTA、无钙镁PBS、MEM/F12培养基

分离纯化步骤

外周血经肝素抗凝处理后，用红细胞裂解液处理去除红细胞，400g离心10分钟收集白细胞沉淀

细胞悬液经200目滤网过滤去除组织碎片，400g离心10分钟收集细胞沉淀，PBS洗涤1次

采用双抗体夹心法结合磁珠分选技术富集目标细胞亚群，纯度可达92%以上

原代培养要点

细胞重悬于含相应细胞因子的完全培养基中，按适当密度接种于低吸附培养皿，37℃、5% CO₂培养

免疫细胞体外存活期有限，建议实验在取材后7-14天内完成，期间定期检测细胞活力

常见问题优化

培养过程中出现污染：严格无菌操作，培养基中添加适量抗生素，定期检测支原体

目标细胞占比低：优化Ficoll梯度离心条件，改进密度梯度分离策略

细胞活化状态改变：缩短体外培养时间，避免过度刺激导致细胞表型改变

一、实验前准备

1. 手术剪、镊子、培养耗材高压灭菌；超净台紫外通风30min。

2. 配制灌洗液 冰预冷PBS缓冲液、消化液（RICAM、淋巴细胞分离液、NH4Cl）、α-MEM + 10% FBS + 1% 双抗、双抗。

3. 人源组织样本（临床手术废弃组织），冰浴预冷所有缓冲液。

二、取材与预处理

1. 经伦理委员会批准获取，75%酒精浸泡消毒体表，无菌操作下暴露并摘取骨髓。

2. 置于冰预冷PBS缓冲液中反复漂洗，去除血污及附属组织，仔细剔除结缔组织。

3. 将纯化后的骨髓组织用眼科剪尽量剪碎，尽量减小组织块大小以利消化。

三、细胞分离与消化

1. 组织碎块与RICAM+淋巴细胞分离液+NH4Cl混合酶液按1:3比例混合，37℃振荡消化35min。

2. 加入含20% FBS的培养基中和酶活性，反复吹打使组织充分分散。

3. 细胞悬液经40μm滤网过滤，1次200g×10min离心洗涤，收集细胞。

四、纯化与接种培养

1. 细胞悬液经40μm滤网过滤，采用Percoll密度梯度离心富集干细胞，去除未消化组织块。

2. 用α-MEM + 10% FBS + 1% 双抗调整细胞浓度至100000.0cells/mL，接种于预涂明胶的培养皿中。

3. 置于37℃、5% CO2培养箱中培养，每2天换液一次，倒置显微镜下观察细胞贴壁及梭形或多角形，贴壁生长，核质比高，核仁明显。