兔脂肪细胞

方法简介  实验室分离的兔脂肪细胞采用胶原酶-中性蛋白酶联合消化结合差速贴壁法，并通过专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的兔脂肪细胞经特异性标志物免疫荧光鉴定，纯度可达85%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： 鼠尾胶原Ⅰ（2-5 μg/cm²）

培养基： 兔脂肪细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 圆形

传代比例： 1:2

传代特性： 可传3-5代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

兔脂肪细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：3-4月龄日本大耳兔，体重2.5-3.0kg，单只取材获1.2-2.8×10⁶个细胞，活率>90%

试剂：中性蛋白酶、胶原酶D、透明质酸酶、FBS、DMEM/F12完全培养基

分离纯化步骤

取材组织经D-Hanks液冲洗后，手工剔除杂质，剪成1-2mm³小块，加入中性蛋白酶、胶原酶D、透明质酸酶、FBS37℃消化60-120分钟

滤过100目滤网后的细胞悬液加入等体积含10% FBS的培养基终止消化，300g离心10分钟

采用预混合抗体标记+磁珠分选策略，特异性富集目标细胞，纯度>85%

原代培养要点

调整细胞浓度至3×10⁴，接种于胶原/纤维连接蛋白包被的培养皿中，37℃、5% CO₂培养

细胞贴壁生长，形态均匀，24-48小时内可见明显贴壁现象，第3-5天可达80-90%融合

常见问题优化

培养过程中出现污染：严格无菌操作，培养基中添加适量抗生素，定期检测支原体

细胞形态异常：检查培养基pH值和渗透压，避免过度传代导致细胞老化

细胞生长缓慢：检查血清批次质量，补充必要生长因子，确保CO₂浓度和温度稳定

一、实验前准备

1. 手术剪、镊子、培养耗材高压灭菌；超净台紫外通风30min。

2. 配制灌洗液 冰预冷D-Hanks液、消化液（胶原酶Ⅰ+BSA）+透明质酸酶、DMEM/F12 + 10% FBS + 1% 双抗、双抗。

3. 健康新西兰大白兔（2.0-2.5kg），3%戊巴比妥钠耳缘静脉注射，冰浴预冷所有缓冲液。

二、取材与预处理

1. 空气栓塞法处死，75%酒精浸泡消毒体表，无菌操作下暴露并摘取脂肪。

2. 置于冰预冷D-Hanks液中反复漂洗，去除血污及附属组织，仔细剔除结缔组织。

3. 将纯化后的脂肪组织用眼科剪尽量剪碎，尽量减小组织块大小以利消化。

三、细胞分离与消化

1. 组织碎块与胶原酶Ⅰ+BSA+透明质酸酶混合酶液按1:3比例混合，37℃振荡消化47min。

2. 加入含20% FBS的培养基中和酶活性，反复吹打使组织充分分散。

3. 细胞悬液经40μm滤网过滤，1次200g×10min离心洗涤，收集细胞。

四、纯化与接种培养

1. 细胞悬液经40μm滤网过滤，采用适当纯化方法去除杂质细胞，去除未消化组织块。

2. 用DMEM/F12 + 10% FBS + 1% 双抗调整细胞浓度至120000.0cells/mL，接种于预涂明胶的培养皿中。

3. 置于37℃、5% CO2培养箱中培养，每2-3天换液一次，倒置显微镜下观察细胞贴壁及圆形，贴壁生长，胞质内可见脂滴空泡。