兔棕色脂肪干细胞

兔棕色脂肪干细胞

实验选用日本大耳白兔，取材后迅速转移至预冷的PBS缓冲液中，经机械分离+酶消化联合获取原代干细胞，接种后置于37°C、5% CO2培养箱中，采用MCDB-131培养基维持培养，每3天换液一次；细胞鉴定采用共聚焦显微镜观察检测Nanog阳性表达率，免疫细胞化学定量CD44表达量，结合Western blot分析下游通路蛋白表达变化，并通过自噬流检测验证细胞生物学活性。

产品名称：兔棕色脂肪干细胞

英文名称： Rabbit Brown Adipose Stem Cells

组织来源： 棕色脂肪组织

默认种属 ：兔

产品规格：5×10^5Cells/T25

方法简介  实验室分离的兔棕色脂肪干细胞采用胶原酶-中性蛋白酶联合消化结合差速贴壁法，并通过专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的兔棕色脂肪干细胞经特异性标志物免疫荧光鉴定，纯度可达85%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： 鼠尾胶原Ⅰ（2-5 μg/cm²）

培养基： 兔棕色脂肪干细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 成纤维细胞样

传代比例： 1:3

传代特性： 可传10代以上

消化液： 0.25%胰蛋白酶

兔棕色脂肪干细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

一、实验前准备

1. 准备无菌手术器械（手术剪、镊子、眼科剪）、培养耗材，高压灭菌后备用；超净工作台紫外消毒。

2. 提前配制冰预冷D-Hanks液、消化液（胶原酶Ⅰ、BSA）、透明质酸酶、DMEM/F12 + 10% FBS + 1% 双抗（37℃预热）、双抗溶液。

3. 健康新西兰大白兔（2.0-2.5kg），3%戊巴比妥钠耳缘静脉注射麻醉，所有试剂冰浴预冷备用。

二、取材与预处理

1. 空气栓塞法处死，碘伏消毒术野，无菌操作取出脂肪组织。

2. 浸入冰预冷D-Hanks液中冲洗干净，仔细分离去除血管、神经及结缔组织。

3. 将组织转移至新的培养皿中，用手术剪精细剪碎成细小碎块。

三、细胞分离与消化

1. 组织碎块加入胶原酶Ⅰ+BSA混合消化液，37℃消化48min，间断吹打。

2. 加入含10% FBS的培养基终止消化，吹打制备单细胞悬液。

3. 200g离心10min收集细胞沉淀，PBS重悬洗涤两遍。

四、纯化与接种培养

1. 细胞悬液过40μm细胞滤网，采用适当纯化方法去除杂质细胞，去除团块和未消化组织。

2. 沉淀细胞用DMEM/F12 + 10% FBS + 1% 双抗重悬，台盼蓝染色检测活力（应>90%），以60000.0-230000.0cells/cm²密度接种。

3. 放入37℃、5% CO2恒温培养箱，每2-3天换液一次，镜检观察圆形，贴壁生长，胞质内可见脂滴空泡及生长状态。

动物取材须在无菌条件下进行，脂肪组织获取后迅速转入含抗生素的Hanks液中转运，组织离体时间超过1小时将严重影响色脂肪干的分离效率和活力。

培养器皿必须提前用0.1mg/ml胶原酶I包被过夜，未包被的培养板色脂肪干贴壁效率极低，影响后续实验结果。

该细胞属于贴壁依赖性细胞，体外增殖速度适中，建议每3天更换一次培养基，传代时按1:3比例操作，避免过度融合导致接触抑制。

培养基中需添加DMEM/F12含10% FBS和1%青霉素-链霉素，其中血清浓度应根据细胞生长状态适当调整，低血清条件有助于减少杂细胞污染但可能影响色脂肪干增殖速度。

换液操作全程注意无菌操作，使用经0.22μm滤膜过滤的新鲜培养基，加入后轻摇培养皿使培养基均匀分布，避免产生气泡影响细胞生长。