| 体外激酶实验 | AKT2,PKA, p70S6K, 和 CDK2/cyclin A 的激酶实验在测量辐射的过滤器结合格式上进行。在AT7867存在时进行实验反应。为了测定AKT2,AKT2酶和 25 μM AKTide-2T 肽(HARKRERTYSFGHHA) 在 20 mM MOPS (pH 7.2), 25 mM β-甘油磷酸，5 mM EDTA, 15 mM MgCl2, 1 mM 钒酸钠, 1 mM DTT, 10 μg/mL 牛血清蛋白，和 30 μM ATP (1.16 Ci/mmol) 中温育4小时。为了测定PKA, PKA 酶和50 μM肽 (GRTGRRNSI) 在2 mM MOPS (pH 7.2), 25 mM β-甘油磷酸, 5 mM EDTA, 15 mM MgCl2, 1 mM 钒酸, 1 mM DTT, 和 40 μM ATP (0.88 Ci/mmol) 中温育20分钟。为了测定p70S6K, p70S6K 酶和 25 μM肽底物(AKRRRLSSLRA) 在 10 mM MOPS (pH 7), 0.2 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 0.01% β-巯基乙醇, 0.1 mg/mL 牛血清蛋白, 0.001% Brij-35, 0.5% 甘油,和15 μM ATP (2.3 Ci/mmol)中温育60分钟。为了测定 CDK2, CDK2/cyclin A 酶和 0.12 μg/mL 组蛋白 H1在 20 mM MOPS (pH 7.2), 25 mM β-甘油磷酸, 5 mM EDTA, 15 mM MgCl2, 1 mM 钒酸钠, 1 mM DTT, 0.1 mg/mL 牛血清蛋白, 和 45 μM ATP (0.78 Ci/mmol) 中温育4小时。所有反应通过加入过量磷酸而终止。终止的反应混合物转移到Millipore MAPH 过滤板上进行过滤。冲洗实验板，加入闪烁剂，在Packard TopCount上通过闪烁计数而测量放射性。通过复制曲线使用 GraphPad Prism 软件计算IC50值。进行AKT1和 AKT3酶实验。 |