BeyoRT™ cDNA链合成试剂盒(RNase H-)
BeyoRT™ cDNA链合成试剂盒(RNase H-),即BeyoRT™ First Strand cDNA Synthesis Kit(RNase H minus)是一种采用了经过改造和优化的BeyoRT™ M-MuLV反转录酶(RNase H-),用于在总RNA、mRNA等RNA模板的基础上反转录产生 cDNA链的试剂盒。本试剂盒包含了进行cDNA链合成所需的各种试剂。 采用本试剂盒可以合成长达13kb的cDNA链。在采用BeyoRT™ M-MuLV反转录酶(RNase H-)的情况下,由于缺失了RNase H,RNA和DNA双链复合物中的RNA不会被降解,这样反转录出来的cDNA的长度就会更长,并且产量更高。 试剂盒中提供了RNase Inhibitor,确保在反转录过程中的RNA不会被RNA酶所降解并取得较好的反转录效果。 试剂盒还提供了Oligo(dT)18和random hexamer这两种引物,前者适合用于带有Poly(A)尾的mRNA的反转录,后者进行反转录时不需要poly(A)尾。也可以自行采用基因特异性引物进行cDNA链的合成。 试剂盒中提供的Control Primer为17聚,即引物的长度为17个碱基。试剂盒中提供的Control RNA为带有3’poly(A)的 1.1kb RNA。 使用本试剂盒合成的链,可以直接用于后续的常规PCR、real-time PCR、cDNA第二条链的合成等。 本试剂盒用于体积为20微升的cDNA链合成反应时足够进行10个cDNA链样品的合成。 包装清单:
保存条件: -20℃保存。 注意事项: 对于GC含量比较高的RNA的反转录,试剂盒的使用说明中给予了特别说明,请予以关注。 本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
使用说明: 1. cDNA条链的合成(First-strand cDNA Synthesi): a. 参考如下表格设置反转录反应:
*To 13.7μl表示加入DEPC-treated Water至最终体积为13.7μl。 70℃孵育5分钟并且随后冰浴冷却,这样可以使RNA模板的二级结构充分打开。 b. 轻轻混匀(可以用Vortex在最低速度轻轻混匀或用移液器吹打混匀),随后离心沉淀液体。 c. 如果使用Oligo(dT)18作为引物或使用基因特异性引物,在42℃孵育60分钟。如果使用random hexamer(随机六聚体)作为引物,先在25℃孵育10分钟,随后在42℃孵育60分钟。 注意:对于GC含量比较高的RNA模板的反转录反应,可以设置为45℃孵育60分钟。 d. 70℃孵育10分钟以失活BeyoRT™ M-MuLV反转录酶(RNase H-)并终止反转录反应。 说明:对于长片断的cDNA不推荐采用加热的方法失活BeyoRT™ M-MuLV反转录酶(RNase H-),这种操作可能会导致部分长片断DNA被剪切。 e. 反转录产物可以直接用于后续的PCR等反应,也可以-20℃冻存以备以后使用。用于后续PCR反应时,如果PCR的反应体系为50微升,则推荐使用2微升反转录产物。 2. 其他用途请自行参考M-MuLV反转录酶(RNase H-)的相关文献资料进行。 常见问题: 1. RNA反转录产物电泳观察不到。 反转录产物由于是从模板反转录而获得,而模板的量本身比较低,反转录的量通常还要少于模板量,因此通常RNA的反转录产物直接电泳观察是观察不到的。 2. 反转录产物通过PCR扩增没有特异性条带。 PCR扩增没有获得特异性条带时建议先使用actin、GAPDH等作为内参进行PCR扩增,看是否可以成功扩增。如果可以成功,则说明PCR扩增体系没有问题,此时通常是目的基因的引物设计欠佳,当然也有可能是反转录产物质量欠佳。如果内参不能被很好地扩增,则有可能PCR体系存在问题或反转录产物质量欠佳。
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