背景技术
急性心功能衰竭(包括慢性心衰急性加重)心衰是指是由于能量不足造成基因表达异常而引起的一种超负荷心肌病，终因能量不足、心肌缺血、心肌细胞的凋亡，心肌收缩单位减少，使得这种超负荷进入恶性循环。
卡培立肽，商品名为卡哌利汀，为28个氨基酸组成的一种循环调节激素，其分子式为:H-Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser-Cys-Phe-Gly-Gly-Arg- Met - Asp -Arg -1Ie-Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr-OH。卡培立妝作为一种治疗急性心功能衰竭(包括慢性心功能衰竭加重)的多肽药物，它通过刺激心肌伸展，由心室内颗粒合成的，然后通过冠静脉分布全身，作用于血管平滑肌和肾脏等组织，调节血压和体内电解质平衡。临床试验证明，卡培立肽在血管平滑肌及肾等组织中与GC-A受体结合，活化鸟苷酸环化酶，使环-磷酸鸟苷增多，而引起血管扩张和利尿用。
目前，关于卡培立肽的研究报道较少，国内外专利数目不多，仅有的几篇专利也多数是采用基因重组技术合成卡培立肽，涉及卡培立肽纯化工艺的专利仅有一篇，公开号CN102382188A。 该专利公布了一种采用磷酸缓冲液纯化、醋酸盐转盐的卡培立肽纯化工艺，但用磷酸缓冲盐纯化过程中，杂质难以得到有效控制，进而影响纯度和收率；用醋酸转盐的过程中，发现卡培立肽盐酸盐稳定性较差。
采用现有技术CN102382188A的方法纯化卡培立肽，纯度只能达到98.5%，总收率约32.1%左右，较难达到成药的纯度和产业化生产的收率。本发明设计新纯化方案，选择新的流动相系统，采用硫酸盐纯化，盐酸转盐，使纯度达到99.65%以上，收率提高到40%以上，显著提高了收率、纯度和更高的稳定性，更易于制药使用和工业化生产。
发明内容
本发明针对现有工艺缺陷，如醋酸盐不稳定、杂质难以分离、不利于放大生产等等，旨在提供一种成本低廉、高收率、工艺过程简单、样品杂质少且稳定可控、有利于实现产业化的卡培立肽纯化工艺。
为实现上述目的，本发明采取以下技术方案:一种卡培立肽的纯化方法，包括以下步骤:
步骤I):用含有机溶剂的水溶液溶解样品(该步骤后述简称为“样品处理”)，制备得到浓度为100g/L的溶液；
步骤I)中，所述的溶解样品所用的有机溶剂为极性强的有机溶剂，包括甲醇、乙腈、二甲基亚砜(DMS0)、或异丙醇等，其中优选DMS0，有机溶剂的体积比浓度为3%~18%，优选5%-15%，更优选是8%-12%。申请人发现，由于卡培立肽本身结构组成的特征，粗品中容易含有各种合成不完全、或消旋化杂质，因此粗肽样品的溶解试剂要求很苛刻。经申请人反复试验后发现，有机溶剂含量在3%~18% (v/v)范围内时，样品溶解性较好，浓度能达到20g/L以上，有机溶剂含量在8%-12% (v/v)范围时，效果浓度能达到40g/L以上；而在摸索不同有机试剂时发现，DMSO、甲醇、乙腈、异丙醇等较强极性的有机试剂对样品的溶解效果较好，其中又以DMSO效果，浓度能达到50g/L以上。
当样品溶液浓度达到20g/L以上，有利于样品的上样和后续分离，优选100g/L的溶液。
步骤2):以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以含高氯酸的硫酸缓冲盐为A相，乙腈为B相，梯度:体积比浓度B%为17%~37%，进样，进行梯度洗脱(该步骤后述简称为“纯化”);
步骤2):使用该洗脱体系，可以有效的保证分离效果和纯化收率，其中，特别是当洗脱体系中B%不在17%~37%范围内，易导致样品不挂柱或提前冲出，达不到分离效果(该步骤后述简称为“纯化”)。现有技术CN102382188A纯化方法收率低，纯度能达98.5%，而本发明纯化收率可达70%以上，收率有大幅提高，纯度99.5%以上且任一杂质不大于0.1%，可以用来标定工作标准品和进行药品注册申报。
步骤2)中，所述的硫酸缓冲盐为加有0.1% — 0.8% (v/v)高氯酸的IOmmol/L-50mmol/L硫酸缓冲盐溶液。在对卡培立肽进行纯化过程中，申请人对不同流动相体系进行分析、对比，找寻的流动相体系。过程中发现，大多数流动相体系只能单纯的除掉部分杂质，一次在纯化过程中为了保证纯度，往往要反复进行多次繁琐的回收纯化才能达到合乎要求的纯度；经过申请人的反复摸索，最终发现加入0.1%—0.8% (v/v)高氯酸的10mmol/-50mmol/L硫酸盐缓冲体系,对除去粗肽中的杂质效果明显,只需一次纯化、一次回收，省去多步重复操作。
步骤2)中，所述的硫酸缓冲盐包括硫酸铵或硫酸三乙胺。硫酸缓冲盐溶液用氢氧化钠或氢氧化钾或氨水调pH2.0-3.0。申请人发现,卡培立肽对于pH值的要求较为苛刻，pH值高于5时，样品容易析出，pH值低于I时，样品稳定性变差，在室温下I小时内HPLC纯度会降低约2%左右。经过反复试验，发现pH2.0-3.0时，样品稳定性，在室温下I小时内HPLC纯度几乎不变。
步骤3):将卡培立肽硫酸盐转成盐酸盐，采用反相HPLC方法，以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，梯度洗脱，冻干得到卡培立肽(该步骤后述简称为“转盐”)。
步骤3)中，所述的转盐包括下述两步骤:用体积比95:5的盐酸缓冲盐的水溶液与乙腈的混合溶液转盐20min，所述的盐酸缓冲盐的水溶液中盐酸缓冲盐的体积比浓度为
0.02%-0.1%、pH值范围为2.0-4.5 ;后用体积比浓度为0.02%_0.5%的盐酸水溶液为A相，乙腈为B相，以体积比浓度B%为5%~25%，进行梯度洗脱30min。
申请人发现，盐酸缓冲盐浓度低于0.02%时，或高于0.1%时，样品不稳定在室温下I小时内HPLC纯度会降低约2%左右。盐酸体系中，盐酸缓冲盐pH值范围为2.0-4.5时，样品均很稳定，在室温下I小时内HPLC纯度几乎不变。
其中，盐酸铵:配置体积比为0.02%~0.1%的盐酸水溶液,用氨水调pH值2.0-4.5即可。本发明中发现转盐低于20分钟转盐不彻底，达不到转盐要求。超过20分钟会导致生产时间延长和物料浪费，增加生产成本。
步骤3 )中，所述的反相HPLC的梯度，体积比浓度B%为5%~25%，进行梯度洗脱，时间为30min。申请人发现，该洗脱体系中B%低于5%样品无法从色谱柱上冲洗下来，B%高于25%虽可以将样品冲洗下来，但不能提高其纯度且会导致有机相的使用量增加，增加了生产成本，在规模化生产时尤为明显。
洗脱低于30分钟会降低此步的分离效果，纯度无法达到99.5%或以上，超过30分钟会使生产时间延长和增加物料的使用量，从而导致生产成本的增加。
本发明此步骤不仅进行了转盐和脱盐，而且还将纯度提高到99.5%以上。
说明书中v/v指的是体积比浓度，二者使用相同的体积单位，例如mL。
使用该洗脱洗脱是根据卡培立肽本身的极性，经过大量的实验筛选得到。如果浓度更低会增加纯化时间，增大纯化成本；如果更高就不能好的转盐效果。
本方法通过纯化，分别除去卡培立肽粗品中的杂质使纯度大于99.65%、单杂小于0.1%、并转成稳定的盐酸盐，工艺稳定可控、纯度高、产率高，稳定性好，具有广泛的实用价值和应用前景。