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柚皮苷

柚皮苷(Naringin)又称柚苷、柑桔苷、异橙皮苷,是从西柚皮中分离的一种双氢黄酮类化合物,有苦味,天然存在于芸香科植物葡萄柚、橘、橙的果皮和果肉中,也是骨碎补、枳实、枳壳、化橘红等中药的主要有效成分之一。各种植物中柚皮苷含量随品种、产地的不同而有较大差别,通常未成熟的果实内柚皮苷含量较高。

柚皮苷具有多方面的生物活性,包括抗氧化作用;对杂环胺类物质等致突变性的抑制作用;抗癌作用;对胃溃疡的防治作用;对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌、埃氏大肠杆菌及某些真菌的抑制作用;抗炎作用;对某些毒物的拮抗作用;降血脂,降血胆固醇作用;解痉,镇痛作用;改善微循环和软骨组织细胞功能作用;降低毛细血管通透性和骨关节病变率作用,促进一些药物在人体内的吸收和代谢的作用等。

柚皮苷 

图1为柚皮苷

【理化性质】
通用名称:柚皮苷
英文名称:Naringin
化学名:(7-[[2-O-(6-Deoxy-α-L-mannopyranosyl)-β-D- glucopyranosyl]]oxy]-2,3-dihydro-5-hydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-4H-1-benzopyran-4-one)
商品名:柚苷、柑桔苷、异橙皮苷、川陈皮素
分子式: C27H32O14
Cas No: 10236-47-2
分子量: 580.53  密度:1.66±0.1 g/cm3
植物来源:芸香科植物柚(Citrus paradisi Macfadyen)果实
柚皮苷系葡萄糖、鼠李糖和柚配质的复合体。白色至浅黄色结晶性粉末,在水中结晶者,为含6~8个结晶水的结晶体,熔点83℃。在110℃下干燥后可得含2个结晶水的物质,熔点171℃。极苦,用水稀释5万倍后仍有苦感。在常温水中的溶解度为0.1%,75℃时为10%。溶于丙酮、乙醇、温醋酸和氢氧化钠液。经水解加氢后所得“柚苷二氢查耳酮”为甜味剂,甜度约为蔗糖的150倍。
溶解性:1g溶于1000ml水,75℃时可达到10%,溶于甲醇、丙酮、乙醇、热乙酸、稀碱溶液、吡啶,甲酰胺及二甲基甲酰胺中,和热水,不溶于石油醚、苯、乙醚、己烷和氯仿。

柚皮苷结构式 

图2为柚皮苷结构式


【提取方法】

1 溶剂萃取法
溶剂萃取法主要是利用柚皮苷在有机溶剂(甲醇或乙醇)中溶解度较大的原理,直接从柚皮中萃取橙皮苷。广西医科大学时雪峰选择 60%(V/V)乙醇作为提取溶剂、在料液比 1∶20、提取温度 90℃条件下,保温浸提 2 h 后,采取柱层析(聚酰胺为填充剂;蒸馏水、95%乙醇作为洗脱液)的方法,从柚皮中分离柚皮苷粗产品,提取率为 2.36%(重结晶后纯度为 76%)。四川大学贾东英等则对上述工艺加以改进,选择 70%(V/V)乙醇作为提取溶剂,在料液比1∶25、提取温度 60℃条件下,保温浸提 1 h 后,柚皮苷的提取率为 6.75%(重结晶后纯度为 90%)。溶剂萃取法提取柚皮苷不仅可使柚皮苷得到有效的提取和分离,而且对柚皮的其他活性成分无破坏作用,其残渣还可用于果胶或纤维素等生理活性成分的制备,或直接作为人类膳食纤维的来源应用于食品加工,因而更有利于资源的综合利用。

2 碱提酸沉法
碱提酸沉法主要是利用柚皮苷在碱性条件下开环溶解,在酸性条件下闭环析出的原理,从柚皮中提取柚皮苷。四川理工学院游见明等采用碱提酸沉法从柚实果皮中提取柚皮苷。试验结果表明:用饱和 Ca(OH)2溶液作溶剂、料液比 1∶10、温度60 ℃、 提取时间 3 h 的条件下, 柚皮苷的提取率为0.84%。 宜春学院闻永举等则对上述工艺进行优化,采用 1%(V/V)Ca(OH)2溶液作溶剂、料液比1∶8、提取温度 80℃、提取 3 次(每次 30 min)工艺条件,柚皮苷的提取率为 26%。 该工艺方法简单、成本低、重复性好,能够用于工业化生产。

3 二氧化碳超临界萃取法
二氧化碳超临界萃取技术的原理是利用超临界二氧化碳对某些天然产物具有的特殊溶解作用,利用超临界二氧化碳的溶解能力与其密度的关系,即利用压力和温度对超临界二氧化碳溶解能力的影响而进行的。 在超临界状态下,将超临界二氧化碳与待分离的物质接触,使其有选择性地把极性大小、沸点高低和分子量大小的成分依次萃取出来,然后借助减压、升温的方法使超临界流体变成普通气体,被萃取物质则完全或基本析出,从而达到分离提纯的目的。美国学者YU等采用二氧化碳超临界萃取技术从柚子种子中提取柚皮苷,在 41.1MPa 的压力下、50℃的提取温度、20%的乙醇浓度、流动相保持 5.0 L/min 的条件下、40 min 内,柚皮苷最高收率可达到 0.2 mg/g(种子)。

4 微波辅助提取法
微波辅助提取法是微波和传统的溶剂萃取法相结合后形成的一种新的萃取方法。 在微波提取中,微波利用其穿透性能够透入基质内部,被辐射物质的极性分子在微波电磁场中快速转向及定向排列,从而产生撕裂和相互摩擦引起发热,使胞内温度迅速升高,连续高温使其内部压力超过细胞空间膨胀的能力,导致细胞破裂,胞内有效成分自由流出,传递到周围被溶解。 另外,微波所产生的电磁场加速了被萃取组分由物料内部趋向萃取溶剂界面的扩散速度,缩短了扩散时间,从而大幅度提高萃取速率,同时也降低了萃取时间,最大限度保证萃取的质量。 北京化工大学王桂花等选择40%(V/V)乙醇为提取溶剂,从枳壳中提取柚皮苷。在微波功率 425 W,液固比为 50 mL/g,萃取时4 min 的最佳条件下,提取率为 4.1%。湖南农业大学苏东林则采取以蒸馏水为溶剂,提取柑橘皮中的黄酮(主要是橙皮苷和柚皮苷)。 其中在微波功率为400 W、萃取时间 3 min、液料比 50∶1、pH 值 5 的条件下,所得黄酮总含量为 3.37%。 研究表明,微波提取法具有萃取时间短、溶剂用量少、提取率高、产品品质好等诸多优点。

5 超声波辅助提取法
超声波辅助提取技术是一种新的提取分离技术。它主要是利用超声波的非热作用-机械作用、空化作用和传统的溶剂萃取法或碱提酸沉法相结合的原理。 超声波在介质传播过程中引起介质质点加速度增大,这也就加大了溶剂进入提取物细胞的渗透性,从而强化了提取过程。 而当空化作用产生时,在固/液非均相体系的接口发生气泡爆破, 破坏了植物的细胞壁,再加上碰撞次数增多、物质交换次数也就增多,细胞膜的透过能力得到增强,使萃取效率提高。浙江大学刘英等采用超声波辅助提取法从四季柚中提取柚皮苷。在提取时间为 1 h时、提取温度 50 ℃、固液比 1∶30、50%乙醇、提取功率 25 W 的条件下,柚皮苷提取率为 5.44%。浙江大学马亚琴等采用 80%(V/V)甲醇作为萃取溶剂从珀溪蜜柚果皮中提取柚皮苷。在超声时间 30 min,固液比 1∶20,超声温度40 ℃,超声功率 8 W 的条件下,柚皮苷的提取率约为 5.00%。湖南大学周强开发了从柚皮中提取柚皮苷的新工艺,即在传统的碱提酸沉方法基础上,引入超声提取技术来强化萃取效果。优选得最佳工艺条件:超声温度 25 ℃、超声时间 30 min、饱和 Ca(OH)2溶液与柚皮质量比 4∶1、超声频率 25 KHz。 按此优选最佳工艺试验 3 次,精制柚皮苷平均收率可达到 1.82%(为常规浸提法的1.58倍)。


【药代动力学】
代谢:据文献报道,大鼠口服柚皮苷单体或含柚皮苷的复合物后,柚皮苷迅速被吸收,5min即可在血浆中被检测到,0.67~1.6h达到最大血药浓度,体内消除半衰期t1/2为3.1~4.1h。柚皮苷主要以柚皮素葡萄糖醛酸、柚皮素硫酸盐等结合物的形式存在于血液中,体内分布广泛,除脑组织外体内各器官均能检测到柚皮苷的存在。柚皮苷存在肝肠循环现象,主要经肝脏或胆汁排泄。
吸收:柚皮苷口服吸收差,大部分被肠道菌群脱糖基化代谢为柚皮素后经肠壁以被动扩散的方式吸收入血。
分布:大鼠灌胃给予柚皮苷15min后,在胃组织、十二指肠、肝、肾及肺中均可检测到柚皮苷的存在,并于60~105min达到最高浓度,720min后各器官基本检测不到。各组织器官柚皮苷浓度高低顺序为:胃组织>十二指肠>肾>肝>肺>脾>脂肪>心脏>肌肉>睾丸,而脑组织、皮肤及卵巢中均检测不到柚皮苷。研究也发现各组织器官的柚皮苷AUC值有相似的大小顺序。研究柚皮苷在脑、肝脏及胆汁中的分布情况,结果发现柚皮苷在肝及胆汁中的分布率(AUCliver/AUCblood和AUCbile/AUCblood)分别为(5.39±0.94)和(29.17±3.58)ng•h•mL-1,而脑中没有检测到柚皮苷,表明柚皮苷在肝及胆汁中富集,而柚皮苷可能不分布于脑组织中。
消除:大鼠口服柚皮苷单体或含柚皮苷的复合物后,柚皮苷的药时曲线呈明显的双峰现象,提示其在体内存在肝肠循环。柚皮苷在尿液中的主要代谢产物为柚皮素、对羟基苯丙酸、对羟基桂皮酸。柚皮苷及其代谢物在体内发生的反应有:羟基化、甲基化、乙酰化、氢化、去糖基化、脱氢化、葡萄糖醛酸化、硫酸化、葡糖基化、开环反应、氧化作用、甘氨酸结合、脱羟基作用等。有研究推断柚皮苷主要代谢途径为口服后首先在肠道菌群的作用下发生脱糖基化反应而生成柚皮素,而后柚皮素以单体或柚皮素结合物的形式通过肠壁吸收进入肝脏,经开环、脱氢反应产生对羟基桂皮酸,或者柚皮素在肝药酶作用下开环、裂解,产生对羟基苯丙酸,最后经脱氢作用产生对羟基桂皮酸。值得注意的是,关于柚皮苷消除的报道较少,且不同研究提出的柚皮苷代谢途径仍有所差异,完整的柚皮苷代谢过程有待进一步研究及证实。

【生物活性】

1 柚皮苷对酶活性的作用
近些年来,心血管循环疾病,如动脉粥样硬化和高胆固醇血症,已逐渐成为多种疾病的主要致死原因。有报道高胆固醇血症可通过抑制3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶并由此降低胆固醇的生物合成速率来有效治疗,柚皮苷具有抑制HMG-CoA还原酶活性的作用,以降低胆固醇生物合成量。在正常机体内,血胆固醇过高呈现胆固醇生物合成增加,柚皮苷与HMG-CoA结合,抑制HMG-CoA还原酶活性,使体内LDL受体减少,达到了降低胆固醇的生物合成的目的。 Hyun等发现柚皮苷能够增加乙醛还原酶(ADH)、乙醛脱氢酶(ALDH)活性、降低肝中甘油三酯及血液和肝脏中总胆固醇的含量,增加高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的含量,增加HDL-C与总胆固醇的比例,并同时降低致动脉硬化指数(AI value),促进胆固醇从血浆到肝脏的转运和胆汁分泌排泄、抑制HDL向VLDL或LDL的转化。因此,柚皮苷可以降低动脉硬化和冠心病的几率。柚皮苷在0.05g• kg-1• d-1或更高的剂量时对HMG-CoA还原酶具有较强抑制作用,而且在鼠实验中几乎没有表现出毒性或促有丝分裂性。当以1000mg/kg的剂量给鼠口服给药时,柚皮苷没有产生毒性,对于50 kg重的人来说,这个剂量相当于口服给药柚皮苷50~100g/kg体重。如上所述,柚皮苷可用做有效抑制HMG-CoA还原酶活性的非毒性药物,对循环系统起到良好的作用。

2 柚皮苷能增强镇静类成分在体内的作用
Sebastirn等研究了黄酮类对中枢神经系统的作用,发现柚皮苷(小鼠给药30mg /kg)可以显著增强戊硫代巴比妥钠的分泌引起小鼠睡眠的时间延长,降低小鼠穿过小洞的次数和在管道中跑动的距离。提示其有一定的镇静、安神作用。遗憾的是,在其镇静机理研究中没有采用柚皮苷作为研究对象,但他认为与黄酮母核连接的糖苷起重要作用。

3 柚皮苷能抵抗体内细胞的凋亡和癌变
柚皮苷抵抗引起细胞凋亡和癌变的化学和物理因素进行的实验很多。日本东北药科大学学者Kanno等对该方面进行了比较系统的研究,研究的化学因素包括阿拉伯糖苷胞核嘧啶引起的氧化细胞凋亡,过氧化氢引起的细胞凋亡,脂多糖引起的小鼠休克和降低含氮氧化物产生的作用等,其机制包括抗氧化作用和抑制NF-kB基因的活性。同时也有学者对柚皮苷抗冈田酸引起的细胞凋亡的作用进行了研究,发现柚皮苷可显著降低其对细胞骨架的破坏。柚皮苷和柚皮素对细胞凋亡的比较实验,发现柚皮素能引起细胞凋亡,柚皮苷不明显,柚苷酶水解后又产生该作用。研究表明,柚皮苷的这种抗细胞凋亡作用是鼠李糖苷产生的。同时,柚皮苷对辐射引起的细胞凋亡和氧化也有一定的抑制作用。有报道柚皮苷可以在不影响香烟中致癌物质NNK代谢的情况下(其代谢产物7-mGua水平不变),显著抑制NNK对DNA链的破坏。同时,由于β-胡萝卜素会增强NNK对DNA链破坏作用,柚皮苷可以降低这种副作用。

4 柚皮苷抗辐射作用
初步研究显示,以2Gy 60Coγ射线照射小白鼠,观察其骨髓细胞正常染色体数(MNCE)和不正常染色体数(MPCE)变化。服用过柚皮苷的小鼠MPCE可明显下降。说明柚皮苷在细胞增殖过程中通过抑制基因
突变来保护小鼠的骨髓细胞。有报道柚皮苷能提高胞内谷胱甘肽S转移酶的酶活性,引起黄曲霉毒素B谷胱甘肽的变化,柚皮苷抗辐射作用主要着眼于消除放射性污染过程中的一些作用,并通过抑制黄曲霉毒素B1的致癌活性而起到抗癌作用。

5 柚皮苷金属配合物的抗氧化作用
柚皮苷与不同金属离子形成的配合物的抗氧化能力不同。有实验证明,柚皮苷-铁配合物的抗氧化活性高于抗坏血酸,而柚皮苷-铜配合物对亚油酸过氧化反应表现出较大的促进作用。柚皮苷与铁盐或锌盐形成金属配合物后其抗氧化活性得到提高,不同柚皮苷的金属配合物具有不同的抗氧化活性。

6 对于过敏性物质的抑制作用
从天然资源中挖掘高效低毒抗过敏活性物质已成为抗过敏研究的热点。黄酮类成分在抗过敏方面具有较好的作用,据报道柚皮苷和新橙皮苷的抗小鼠3相皮肤炎作用进行了研究,发现这两种成分均具有有效的抑制作用,为进一步的研究开发奠定基础。

7 对内分泌系统的作用
通过抑制胰腺B细胞因氧化而导致的凋亡,调控脂肪酸、胆固醇和葡萄糖代谢酶的表达水平及活性,柚皮苷可以促进肝脏内糖的分解,降低肝糖浓度,从而达到对早期糖尿病和并发症的防护作用。

8 其他生物活性作用
柚皮苷除了以上提到的生物活性外,还有如下的活性。在许多关于柚皮苷及其苷元柚皮素对于其他药物生物利用度等药代动力学过程影响的报道中,CYP3A或p-gp的底物与酶的结合可以被柚皮苷或柚皮素竞争抑制,从而抑制该底物在肠道以及肝脏中的首过作用,提高其生物利用度。有报道表明: 200mg /L浓度的柚皮甙对口炎疱疹病毒有很强的抑制作用,柚皮甙还可降低血液的粘稠度、减少血栓的形成,并有镇痛、镇静以及较强的增加胆汁分泌的作用。另外,柚皮苷对急、慢性支气管炎、咳嗽痰多等病症具有明显的疗效。

【用途】
(1)苦味剂。柚皮苷经水解加氢所得柚苷二氢查耳酮为甜味剂,甜度约为蔗糖的150倍。
(2)柚皮苷有明显的抗炎作用,可降低血液的粘滞度,减少血栓的形成,并有镇痛、镇静及增加实验动物胆汁分泌的作用。
(3)天然色素、风味改良剂和苦味剂用于食品、饮料的生产,又可作为合成高甜度、无毒、低能量的新型甜味剂二氢柚苷查耳酮和新橙皮苷二氢查耳酮的原料。柚皮苷还可在其它领域应用。邹洪报道:柚皮甙有阻断邻苯三酚自氧化的自由基链反应,即柚皮甙有抗氧化性作用。

【含量测定】

1.HPLC法一
(1)色谱条件 色谱柱:十八烷基硅烷键合硅胶柱;流动相:甲醇-乙酸-水(35:4:61)为流动相;检测波长:283nm。理论板数按柚皮苷峰计算应不低于1000。
(2) 对照品溶液的配制 精密称取在110℃干燥至恒重的柚皮苷对照品适量,加甲醇制成每毫升含0.06mg的溶液,作为对照品溶液。
(3) 样品溶液的制备 取本品粗粉约1g[同时另取本品粉末测定水分(中华人民共和国药典2000年版 (一部) 附录ⅨH二法)],精密称定,置索氏提取器中,加石油醚(60~90℃) 80ml,置水浴上加热回流2~3h。弃去石油醚,药渣挥去石油醚,加甲醇80ml,再置水浴上加热回流3h至提取液无色。放冷,过滤,滤液置100ml量瓶中,用少量甲醇分数次洗涤容器,洗液滤入同一量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀。精密量取5ml,置25ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,即得。
(4) 测定 分别精密吸取对照品溶液5μl,样品溶液3~20μl,注入液相色谱仪,测定含量。
(5) 测定结果 以干燥品计算橘红中含柚皮苷 (C27H32O14•2H2O) 不少于1.5%。

2.HPLC法二
(1) 色谱条件 色谱柱:μ-Bondapak C18 (4.6mm×25cm); 流动相: 磷酸盐缓冲液-乙腈 (5.5:1) (磷酸盐缓冲液:取磷酸二氢钠2.8g,加水溶解至1000ml,加磷酸约0.5ml,调pH至3.1); 流速: 1.0ml/min; 检测波长: 283nm。
(2) 对照品溶液的配制 准确称取110℃干燥至恒重的柚皮苷对照品适量,加甲醇制成每毫升含0.2mg的溶液,作为对照品溶液。
(3) 样品溶液的制备 取炮制骨碎补粉碎成细粉,过40目筛,取粉末0.5g,精密称重,置三角瓶中,加60%甲醇30、20ml,水浴回流。第一次1h,第二次0.5h,过滤,合并滤液。水浴浓缩至约10ml,移至25ml量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,作为样品溶液。
(4) 测定 精密吸取样品及对照品溶液各10μl,进样分析,计算含量。
(5) 色谱图
样品的高效液相色谱图 

图3为样品的高效液相色谱图

(6) 测定结果

批炮制骨碎补中柚皮苷的含量 

图4为批炮制骨碎补中柚皮苷的含量(%)

3.HPLC法三
(1) 色谱条件 色谱: μ-BondapaktmC18 (3.9mm×30cm); 柱温: 30℃; 流动相:甲醇-乙酸-水 (30:5:65); 流速: 2ml/min; 检测波长: 280nm。
(2) 对照品溶液的配制 精密称取柚皮苷、新橙皮苷各适量,分别加甲醇制成每毫升含0.3mg的溶液,作为对照品溶液。
(3) 样品溶液的制备 取样品粉末 (3号筛) 约0.1g,精密称定,置于25ml量瓶中,加甲醇20ml,超声振荡提取20min,放至室温,加甲醇稀释至刻度,摇匀,取溶液适量,离心,取上清液作为样品溶液。
(4)测定 精密吸取样品及对照品溶液各10μl,注入液相色谱仪,分析,即得。
(5)测定结果

枳壳及麸炒枳壳中新橙皮苷及柚皮苷含量 

图5为枳壳及麸炒枳壳中新橙皮苷及柚皮苷含量(%)

【参考资料】
[1] 苏玲,刘启德. 柚皮苷生物活性和药代动力学研究新进展[J]. 中国医药技术经济与管理,2008,10:74-80.
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[3] SCIFinder数据.
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[5] 朱宏平,熊玉卿. 柚皮苷的药物代谢动力学研究概况与进展[J]. 中国临床药理学与治疗学,2013,11:1297-1303.
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[8]
http://www.chemicalbook.com/ProductChemicalPropertiesCB8288064.htm
[9] http://baike.baidu.com/view/140624.htm

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