索马鲁肽的应用与制备方法

2020/5/8 10:27:03

背景及概述[1-2]

索马鲁肽是一种新的长效GLP-1类似物,每周皮下注射1次,可使2型糖尿病患者血糖水平大幅改善,并且低血糖风险较低。同时,索马鲁肽还能够通过降低食欲和减少食物摄入量,诱导减肥,还能够显著降低2型糖尿病患者重大心血管事件风险。最近,丹麦诺和诺德公司公布了最新的临床研究结果,无论是降糖,还是减重,索马鲁肽均优于目前市场上表现的GLP-1降糖新药度拉鲁肽。

索马鲁肽是继艾塞那肽、利拉鲁肽、阿必鲁肽、度拉鲁肽和利西拉来后第6个上市的GLP-1受体激动剂类药物,是第3个每周1次的长效GLP-1类降糖药。美国食品和药品管理局于2017年12月7日批准诺和诺德公司研发的GLP-1受体激动剂索马鲁肽(semaglutide,OZEMPIC®)上市,用于治疗2型糖尿病。目前,该公司在积极开发索马鲁肽的口服剂型。索马鲁肽是通过基因重组技术,利用酵母生产的人胰高糖素样肽-1类似物,与人GLP-1具有94%的序列同源性。它结合饮食和运动,用于2型糖尿病成人患者的血糖控制,经皮下注射给药,每周1次,注射部位可选择腹部、大腿或者上臂。上市剂型为注射剂,本品为可调节剂量、一次性预填充注射笔,由笔型注射器和装有1.5mL液体(含2mg索马鲁肽)的笔芯组成。

药效学[1]

索马鲁肽与GLP-1受体的相互作用介导,导致环磷酸腺苷(cAMP)的增加,能够以葡萄糖浓度依赖的模式刺激胰岛素的分泌,同时以葡萄糖浓度依赖的模式降低过高的胰高糖素的分泌。因此,当血糖升高时,胰岛素分泌受到刺激,同时胰高糖素分泌受到抑制。与之相反,在低血糖时利拉鲁肽能够减少胰岛素分泌,且不影响胰高糖素的分泌。索马鲁肽也能轻微延长胃排空时间,给药剂量为3mg,没有产生QTc延长。

药动学[1]

索玛鲁肽的生物利用度为89%,血药浓度在给药1~3d后出现。每周皮下给药0.5mg和1mg索马鲁肽,稳态血药浓度分别为65.0ng·mL-1和123.0ng·mL-1。索玛鲁肽的表观分布体积大约12.5L,它在体内结合血浆球蛋白。索玛鲁肽的表观清除速率为0.05L·h-1,半衰期接近1周。它在体内的降解主要通过蛋白酶水解及侧链脂肪酸的β-氧化,通过尿和粪便排出体外。

不良反应[1]

索马鲁肽导致的常见不良反应(发生率高于5%)包括恶心、呕吐、腹泻和便秘。

药物相互作用[1]

体外实验证实,索马鲁肽并不抑制或诱导CYP酶,与药物转运蛋白也不发生作用。索马鲁肽可致胃排空延迟,与口服药物同用时可以降低口服药物的吸收速率和吸收程度。目前尚未发现索马鲁肽与二甲双胍、阿托伐他汀、华法林、地高辛及口服避孕药有相互作用。

制备[3]

1)肽树脂的合成

称取替代度为0.993mmol/g的2-CTC树脂100g,加入到固相反应容器中,用DCM洗涤两次后,加入DCM溶胀30min,溶胀完全后树脂减压抽干待用。将Fmoc-Gly-OH(8.92g,30mmol)和DIEA(38.77g,300mmol)溶解在DCM(500ml)中,待溶解澄清后加入至上述2-CTC树脂中开始合成Fmoc-Gly-树脂,反应温度控制在25-30℃间,反应3h。反应完全后,用DCM洗涤树脂2次,每次500ml。树脂再加入甲醇/DCM=1/4(500)、DIEA(129.13g,1000mmol),在25-30℃封端1h,封端完成后用DCM洗涤树脂2次,每次500ml,加入甲醇收缩树脂并干燥,得到Fmoc-Gly-树脂,用紫外分光光度计法检测其替代度为0.29mmol/g。将Fmoc-Gly-树脂加入固相反应容器,加入DMF溶胀30分钟后,加入20%哌啶DMF溶液(500ml),反应半小时后,用DMF洗涤3次,用DCM洗涤3次后,茚三酮检测树脂呈现蓝色。将Fmoc-Arg(Pbf)-OH(37.50g,57.80mmol),HOBt(7.81g,57.80mmol)和DIC(7.29g,57.80mmol)在低温的DMF(500ml)中活化15分钟后,加入到树脂中,25-30℃间反应2个小时,用茚三酮方法检测树脂呈现无色,表示反应完成,用DMF洗涤4次后,用DCM洗涤3次,得Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-树脂。重复上述脱除Fmoc和氨基酸偶联步骤,按照索马鲁肽序列,依次完成Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Val-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Trp(Boc)-OH,Fmoc-Ala-OH,Fmoc-Ile-OH,Fmoc-Phe-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Lys(Alloc)-OH,Fmoc-Ala-OH,Fmoc-Ala-OH,Fmoc-Gln(Trt)-OH,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Tyr(tBu)-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH的偶联,得到肽树脂,其序列为Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-树脂。

2)侧链片段的合成

称取替代度为0.993mmol/g的2-CTC树脂100g,加入到固相反应容器中,用DCM洗涤两次后,加入DCM溶胀30min,溶胀完全后树脂减压抽干待用。将Fmoc-AEEA-OH(77.08g,200mmol)和DIEA(129.13g,1000mmol)溶解在DCM(1000ml)中,待溶解澄清后加入至上述2-CTC树脂中开始合成Fmoc-Val-树脂,反应温度控制在25-30℃间,反应3h。反应完全后,用DCM洗涤树脂2次,每次1000ml。树脂再加入甲醇/DCM=1/4(1000)、DIEA(129.13g,1000mmol),在25-30℃封端1h,封端完成后用DCM洗涤树脂2次,每次1000ml,加入甲醇收缩树脂并干燥,得到Fmoc-AEEA-树脂,用紫外分光光度计法检测其替代度为0.98mmol/g。将Fmoc-AEEA-树脂加入固相反应容器,加入DMF溶胀30分钟后,加入20%哌啶DMF溶液(1000ml),反应半小时后,用DMF洗涤3次,用DCM洗涤3次后,茚三酮检测树脂呈现蓝色。将Fmoc-AEEA-OH(75.54g,196mmol),HOBt(26.22g,194mmol)和DIC(24.74g,196mmol)在低温的DMF(1000ml)中活化15分钟后,加入到树脂中,25-30℃间反应2个小时,用茚三酮方法检测树脂呈现无色,表示反应完成,用DMF洗涤4次后,用DCM洗涤3次,得Fmoc-AEEA-AEEA-树脂。重复上述脱除Fmoc和氨基酸偶联步骤,按照索马鲁肽序列,依次完成Fmoc-AEEA-OH,Fmoc-AEEA-OH,Fmoc-Glu-OtBu,Oct-OtBu的偶联,得到第二肽树脂,其序列为Oct(tBu)-r-Glu(tBu)-AEEA-AEEA-树脂。将上述第二肽树脂加入TFE/DCM=1/4(1000ml)于25-30℃裂解,收集裂解液,树脂用DCM洗涤2次,合并裂解液和洗涤液。重复裂解1次,收集上述两次的裂解液和洗涤液并在40℃下减压浓干,得到侧链片段粗品。将侧链片段粗品溶解在DCM(500ml)中,经硅胶过滤,DCM/MeOH=20/1洗涤后获得侧链片段(Oct(tBu)-r-Glu(tBu)-AEEA-AEEA-OH)。

3)六肽片段的合成

称取替代度为0.993mmol/g的2-CTC树脂100g,加入到固相反应容器中,用DCM洗涤两次后,加入DCM溶胀30min,溶胀完全后树脂减压抽干待用。将Fmoc-Val-OH(67.88g,200mmol)和DIEA(129.13g,1000mmol)溶解在DCM(1000ml)中,待溶解澄清后加入至上述2-CTC树脂中开始合成Fmoc-Val-树脂,反应温度控制在25-30℃间,反应3h。反应完全后,用DCM洗涤树脂2次,每次1000ml。树脂再加入甲醇/DCM=1/4(1000)、DIEA(129.13g,1000mmol),在25-30℃封端1h,封端完成后用DCM洗涤树脂2次,每次1000ml,加入甲醇收缩树脂并干燥,得到Fmoc-Val-树脂,用紫外分光光度计法检测其替代度为0.97mmol/g。将Fmoc-Val-树脂加入固相反应容器,加入DMF溶胀30分钟后,加入20%哌啶DMF溶液(1000ml),反应半小时后,用DMF洗涤3次,用DCM洗涤3次后,茚三酮检测树脂呈现蓝色。将Fmoc-Asp(OtBu)-OH(79.82g,194mmol),HOBt(26.22g,194mmol)和DIC(24.48g,194mmol)在低温的DMF(1000ml)中活化15分钟后,加入到树脂中,25-30℃间反应2个小时,用茚三酮方法检测树脂呈现无色,表示反应完成,用DMF洗涤4次后,用DCM洗涤3次,得Fmoc-Asp(tBu)-Val-树脂。重复上述脱除Fmoc和氨基酸偶联步骤,按照索马鲁肽序列,依次完成Fmoc-Val-OH,Fmoc-Asp(tBu)-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Thr(tBu)-OH,Fmoc-Phe-OH,Fmoc-Thr(tBu)-OH的偶联,得到第三肽树脂,其序列为Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(tBu)-Val-树脂。上述第三肽树脂加入TFE/DCM=1/4(1000ml)于25-30℃裂解,收集裂解液,树脂用DCM洗涤2次,合并裂解液和洗涤液。重复裂解1次,收集上述两次的裂解液和洗涤液并在40℃下减压浓干,得到六肽片段粗品,将六肽片段粗品溶解在DCM(500ml)中,经硅胶过滤,DCM/MeOH=20/1洗涤后获得六肽片段。

4)第四肽树脂的合成

取肽树脂和六肽片段按上述脱除Fmoc和氨基酸偶联步骤合成得到第四肽树脂。

5)第五肽树脂的合成

取第四肽树脂按上述脱除Fmoc和氨基酸偶联步骤依次完成Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Aib-OH,Boc-His(trt)-OH的偶连,得到第五肽树脂。

6)索马鲁肽粗品的合成

取第五肽树脂,加入苯硅烷/DCM=1/4(500ml)和四三苯基膦钯(3.35g,2.90mmol),氮气鼓吹反应1h脱除Alloc保护基,再用DMF(500ml)洗涤4次,DCM(500ml)洗涤3次后抽干待用。将侧链片段(Oct(tBu)-r-Glu(tBu)-AEEA-AEEA-OH)(49.08g,58.00mmol),HOBt(7.84g,58.00mmol)和DIC(7.32g,58.00mmol)在室温下溶解于DMF(500ml)中,氮气保护下低温活化0.5h,将活化后的侧链片段加入至上述脱保护后的第五肽树脂,25-30℃偶联反应6h,用茚三酮方法检测树脂呈现无色,表示反应完成,用DMF(500ml)洗涤4次,DCM(500ml)洗涤3次,树脂抽干得索马鲁肽树脂。将TFA、PhSMe、PhOH、EDT、Tis和H2O按体积比80∶5∶5∶2.5∶2.5配制的混合溶液(500ml),加入至上述索马鲁肽树脂中,氮气保护室温条件下25-30℃进行裂解2h,并用TFA(500ml)洗涤一次,合并裂解液,25-30℃浓缩至体积约为200ml,加入MTBE沉淀产物,室温下搅拌10min,再放入2-8℃冰箱过夜。离心收集所述固体,用MTBE洗涤三次,真空干燥所述产物,获得101.40g纯度为85.2%的索马鲁肽粗品。

7)索马鲁肽粗品的纯化

取2g索马鲁肽粗品经制备型Prep-HPLC纯化产生索马鲁肽纯品1.18g,Prep-HPLC纯化条件:色谱柱:WatersC18250×19、5u、130A;流速:8mL/min;检测:UV,220nm;流动相:A.乙腈;B.0.25%醋酸/水;方法:20%-30%A,10min;30-60%A,40min,制得的索玛鲁肽纯品的纯度为99.645%,收率为59.00%。

主要参考资料

[1]张恩景,李玉萍.长效胰高血糖素样肽-1受体激动剂索马鲁肽[J].中南药学,2018,16(06):817-820.

[2] 朱翊,封宇飞.GLP-1受体激动剂索马鲁肽的药理与临床评价[J].临床药物治疗杂志,2018,16(03):17-21+27.

[3]CN201910677458.3一种索马鲁肽的合成方法

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