背景[1-3]
人胱抑素C(CYSC)ELISA KIT应用双抗体夹心法测定标本中人胱抑素C（CysC）水平。用纯化的人胱抑素C（CysC）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入胱抑素C（CysC），再与HRP标记的羊抗人抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的胱抑素C（CysC）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人胱抑素C（CysC）浓度。
胱抑素C（Cystatin C，CYSC）是一种碱性分糖化的分泌性蛋白质，属于半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族，分子量为13.3kDa。所有有核细胞都能够生产CYSC，其产生率恒定，分泌及排泄均不受任何外来因素的影响，如性别、年龄、饮食等。肾脏是清除循环中CYSC的惟一器官，且CYSC生成速度及其在血液中含量都相对稳定，受其他因素影响较小。因此CYSC是反映早期肾小球滤过率变化（glomerular filtration rate，GFR）理想、可靠的内源性标志物。FDA指出该指标较尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）有更高的敏感性和特异性，强调该项目应该在全球范围内推广。正常情况下，CYSC在血清和血浆中的浓度为0.51-1.09mg/L（参考范围）。当肾功能受损时，CYSC在血液中的浓度随肾小球滤过率变化而变化。肾衰时，肾小球滤过率下降，CYSC在血液中浓度可增加10多倍；若肾小球滤过率正常，而肾小管功能失常时，会阻碍CYSC在肾小管处的吸收和分解，使尿中的浓度增加100多倍。
应用[4][5]
人胱抑素C(CYSC)ELISA KIT用于人胱抑素C可溶性表达、多克隆抗体制备及检测方法建立研究。
胱抑素C（Cystatin C，CysC）即半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白C，是一种非糖基化的碱性低分子量蛋白质。该蛋白能够在所有有核细胞中稳定表达，几乎不受年龄、性别、体重、感染、饮食、体表面积等因素的影响。胱抑素C是迄今为止基本能够满足肾小球滤过率（GFR）理想内源性标志物要求的物质，对于早期肾功能损伤的诊断和治疗具有重要意义。其检测方法主要是免疫学法，但目前国内CysC诊断试剂及标准品主要由国外公司提供，价格昂贵，使病人和社会医疗成本较高。因此，胱抑素C免疫诊断试剂盒的自主研发具有重要的价值和意义。用Trx-CysC作为免疫原免疫新西兰大白兔获得CysC的多克隆抗体，建立CysC颗粒增强透射免疫比浊法（particle enhanced turbidimetric immunoassay，PETIA）并进行初步方法学评价，为该方法的临床应用奠定基础。
方法：1.在不改变氨基酸序列的前提下，对CysC的全长编码基因进行大肠杆菌同义密码子偏好性优化后人工合成其序列，并插入原核表达载体pET32（a+），构建CysC优化后的原核表达质粒pET32（a+）-CysC。经测序鉴定正确后，将该重组质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）中，经IPTG诱导重组蛋白可溶性表达并纯化获得Trx-CysC。2.从HL60细胞株提取总RNA，行RT-PCR获得cDNA模板，再经高保真PCR获得CysC的DNA片段。将该人CysC的全长编码基因插入原核表达载体pCold TF,构建CysC原核表达质粒pCold TF-CysC。待测序结果与预期相符后，将该重组质粒pCold TF-CysC转化到大肠杆菌BL21（DE3）中，经IPTG诱导重组蛋白表达并纯化获得可溶性重组蛋白TF-CysC。利用GST-HRV3C蛋白酶切除该融合蛋白的TF标签，再经分子筛去除TF标签、3C蛋白酶获得无蛋白标签的CysC，SDS-PAGE鉴定其纯度。3.用纯化的重组蛋白Trx-CysC作为免疫原免疫新西兰大白兔，经蛋白A柱纯化制备CysC多克隆抗体。
参考文献
[1]Glomerular filtration rate estimation in patients with type 2 diabetes:creatinine-or cystatin C-based equations?[J].F.Iliadis,T.Didangelos,A.Ntemka,A.Makedou,E.Moralidis,A.Gotzamani-Psarakou,T.Kouloukourgiotou,D.Grekas.Diabetologia.2011(12)
[2]An overview of enzymatic reagents for the removal of affinity tags[J].David S.Waugh.Protein Expression and Purification.2011(2)
[3]Cystatin C,a marker for successful aging and glomerular filtration rate,is not influenced by inflammation[J].Anders Grubb,Jonas Bjö,rk,Ulf Nyman,Joanna Pollak,Johan Bengzon,GustavÖ,stner,Veronica Lindströ,m.Scandinavian Journal of Clinical&Laboratory Inv.2011(2)
[4]Cystatin C:current position and future prospects[J].Sophie Séronie-Vivien,Pierre Delanaye,Laurence Piéroni,Christophe Mariat,Marc Froissart,Jean-Paul Cristol.Clinical Chemistry and Laboratory Medicine.2008(12)
[5]陈特.人胱抑素C可溶性表达、多克隆抗体制备及检测方法的建立[D].重庆医科大学,2012.