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如何从琼脂糖凝胶中纯化DNA

发布日期:2021/7/28 17:32:59

背景资料

凝胶纯化可以根据大小分离和纯化DNA片段。该程序从标准琼脂糖凝胶电泳开始,根据碱基对的长度分离DNA。在电泳后,可以从琼脂糖凝胶中切下DNA条带,然后纯化DNA样品。这是一种常用的分子克隆技术,例如基于克隆的聚合酶链反应或限制性酶。

实验步骤

1.根据琼脂糖凝胶电泳的Protocol做如下修改:

注:凝胶纯化可以使用尽可能低浓度的琼脂糖凝胶(在可分辨的范围),所以如果可能的话保持在0.7%-0.8%的范围内。

注:需要得到分辨更好的条带。这可以通过使用更宽的凝胶梳和在较低电压下运行凝胶来实现。

注:如果想要预留更多的位置来切取条带和减少DNA污染,可以在样品-样品之间预留空泳道。

注:为了减少DNA损伤的风险,最好限制DNA在紫外线下暴露的时间。

2.一旦凝胶电泳结束,需要把凝胶移动到一个紫外线箱中(确保适当的紫外线保护--尤其是对你的眼睛!),由于塑料会阻挡大部分紫外线,所以需要从凝胶托盘上取下凝胶,之后用干净的无菌刀片,从凝胶中切取所需的DNA片段。

注:为了保护紫外线箱,如果可以的话,把凝胶放在玻璃板上是个好主意。与塑料托盘相比,玻璃板将不会显著减少紫外线,但将保护紫外线盒不被刀片切割。

注:试着将条带周围多余的凝胶去除。在DNA纯化过程中,这一点尤为重要,因为许多试剂盒不能在一个体系中处理超过固定体积的凝胶。

3.将凝胶放入标记的EP管中。

4.用秤称量。用空管对体系进行校零,之后对凝胶进行称重。或者,可以用凝胶管的重量减去空管的重量。凝胶的重量与其液体体积成正比,用于确定在DNA分离过程中每个缓冲液的添加量。

5.最后,需要从凝胶中分离出DNA。这是可以使用商用的凝胶纯化试剂盒。遵循相关说明书完成实验即可。

注:在使用凝胶纯化的DNA进行下一步实验之前,确定分离出的DNA的浓度通常是很重要的。

提示和常见问题

怎样才能更好地提高条带的分辨率?

提高DNA条带分辨率的几种简单方法包括:

(A)在较低电压下运行较长时间的电泳;

(B)使用更宽的凝胶梳;

(C)在上样孔中加入较少的DNA。

怎样才能更好地分离条带?

如果大小相近的条带,可以通过调整凝胶百分比,使之更好的分离。较高比例的琼脂糖凝胶将有助于分离较小的条带,而较低百分比的凝胶将有助于分离较大的条带。

10%规则:

对于样品,要比所需的体积多10%,因为可能会在上样过程中丢失几个微升。例如,如果要在10μL中加1.0μg的DNA,则在11μL中加入1.1μg。

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