背景及概述[1][2]
牡荆素学名为5,7,4’-三羟基黄酮-8-C-β-D-葡萄糖苷，是从干燥山楂叶中分离提取得到的一种活性单体，是最具代表性的黄酮碳苷天然产物之一。牡荆素具有活血化瘀、防癌抗癌、抗氧化、抗炎、促进成骨分化等广泛的药理作用。相关研究结果显示该化合物具有增加冠脉和心肌血流量、降低血管阻力、降低血浆黏度、抑制血栓形成、保护心脏免受心肌缺血和再灌注损伤等作用，临床上牡荆素广泛用于治疗心血管疾病。
提取方法[1]
现在，许多植物提取厂家都在生产牡荆素类植物提取物，除了牡荆提取物以外，还有山楂提取物等。他们都是以牡荆素为指标在生产，产品也是以牡荆素为指标向客户销售。但是这类提取物所含的牡荆素含量都很低，如山楂提取物中牡荆素的含量只有0.7％左右。从天然植物中提取分离牡荆素、异牡荆素一般采用硅胶柱色谱、SephadexLH-20柱色谱和制备HPLC联用的方法，工艺都比较复杂。
本发明的发明目的在于克服现有的天然产物提取物中，牡荆素和异牡荆素含量不高等缺点，提供一种从天然产物中提取分离并同时获得含量大、高纯度的牡荆素和异牡荆素的方法。一种从天然产物中提取分离异牡荆素和牡荆素的方法，所述天然产物为檀香叶。所述提取分离方法，可以参照现有的从其它天然产物中提取分离牡荆素和异牡荆素的方法进行。
作为一种优选方案，所述方法优选为以醇类溶剂对檀香叶进行提取得到醇提物，用酯类溶剂对醇提物进行萃取，所得酯类溶剂萃取物经过柱层析和制备液相分离分别得到异牡荆素和牡荆素。所述醇类溶剂为常用的低分子量醇类溶剂，作为一种优选方案，所述醇类溶剂优选为乙醇。所述酯类溶剂为常用的低分子量酯类溶剂，作为一种优选方案，所述酯类溶剂优选为乙酸乙酯。作为一种更优选方案，所述从天然产物中提取分离牡荆素和异牡荆素的方法，包括如下步骤：（1）用乙醇对檀香叶进行超声和/或浸提，得到檀香叶乙醇粗提物；
（2）依次采用石油醚、氯仿、乙酸乙酯对檀香叶乙醇粗提物进行液液萃取；收集乙酸乙酯萃取液，浓缩，干燥，得到乙酸乙酯萃取物；
（3）将步骤（2）得到的乙酸乙酯萃取物在层析柱中进行分离；所述分离选用乙酸乙酯、甲醇组成的洗脱剂进行梯度洗脱，收集合并洗脱液，对洗脱液进行重结晶，得到异牡荆素；
（4）步骤（3）重结晶后的余液进行制备液相分离纯化，得到牡荆素。
代谢[2]
1 牡荆素质谱裂解分析
牡荆素碎片离子图见图 3。牡荆素(C21H20O10)保留时间为 6.84 min，正离子模式给出准分子离子峰 m/z 为433.1118 [M+H]+；在 Q-TOF-MS/MS中，牡荆素的飞行时间质谱主要有3 条裂解途径：
①母离子葡萄糖基的环破裂，失去小分子 C4H8O4，伴随氢原子的1，3 移变形成醛的奇电子离子a(M-120，m/z 313.07)，该离子不稳定，失去醛基自由基正离子，即黄酮苄基离子b(M-150，m/z283.06)；
②母离子的葡萄糖基的环破裂和重排，分别形成离子c(M-96，m/z 337.07) 和离子d(m/z 323.09)；
③母离子连续失水，分别形成离子 e(m/z 415.10) ， 离子f(m/z397.09) 和 离子g(m/z379.08)，离子 g 继续破环失去小分子 C4H4O2 形成离子 h(m/z 295.06)，失去 CH2CO 形成离子 c；牡荆素的具体裂解途径见图4。
2 牡荆素代谢产物分析
使用 Metabolynx XS 筛选得到代谢产物共 3个，包括一相代谢产物 1 个，二相代谢产物2 个。主要代谢反应包括氧化，甲基化和 D-葡萄糖醛酸结合反应等。详细见表 1~2。
M1(C22H22O11)，保留时间为 7.51 min，准分子离子峰为 m/z 463.122 4[M+H]+，比母药 多30 Da；在 Q-TOF-MS/MS 中，母离子糖环失去 1分子 H2O 获得碎片 m/z 445.13，再失去1 分子H2O获得碎片 m/z 427.10，进一步失去甲氧基得到碎片m/z 397.09；糖环破裂失去分子 C4H8O4，获得碎片m/z 343.08(M-120)，进一步失去醛基自由基或甲氧基获得碎片 m/z 313.07，通过失去醛基获得的碎片m/z 313.07 失去甲氧基可获得碎片 m/z 283.06；母离子糖环破裂进行重排，失去分子 CH2CO，形成碎片m/z 421.24，若失去 CH2，获得碎片 m/z 397.09；母离子糖环失去分子 C2H8O4，形成碎片 m/z 367.08(M-96)，失去甲氧基获得碎片 m/z 337.08，所以可以推测代谢物 M1 为甲氧基牡荆素， 可能发生甲氧基取代位点分别为 6，2’，3’，5’和 6’，具体位点需要通过核磁共振分析手段进一步确证。其质谱图见图5A。 M2 和 M3(C27H28O16)，准分子离子峰分别为 m/z 609.146 4[M+H]+和 m/z 609.147 4[M+H]+，保留时间分别为 4.66 min 和 5.95 min， 准分子离子比母药分子离子峰多 C6H8O6(176 Da)，应该是葡萄糖醛酸，如图 5B 和图5C 所示，在 M1和M2的Q-TOF-MS/MS 中，可见特征碎片离子 m/z433.11(M-176)为牡荆素准分子离子，而且m/z415.10，397.09，337.07，313.07，283.06 为牡荆素的特征碎片离子，所以推测该 2 个代谢物是牡荆素的葡萄糖醛酸结合产物，并且推测它们为同分异构体，从牡荆素的结构式可以看出，比较容易发生葡萄糖醛酸化结合位点分别为5，7， 4’的羟基，具体位点需要通过核磁共振分析手段进一步确证。
主要参考资料
[1] CN201110128215.8 一种从天然产物中提取分离牡荆素和异牡荆素的方法
[2]徐聪,楼燕,卢祺炯,王佳虹,辛艳飞,郑高利.牡荆素在大鼠体内的代谢研究[J].中国现代应用药学,2018,35(09):1365-1369.