背景[1-3]
人SV40转染成骨细胞（hFOB 1.19细胞）是在0.6mg/mL新霉素G418存在下，用温度敏感的表达载体pUCSVisA58转染自然流产的胎儿四肢组织建立的细胞系。在许可温度33.5℃下细胞分裂很快，而在限制温度39.5℃下细胞极少分裂或不分裂。hFOB 1.19细胞具有分化为表达造骨细胞表型的成熟造骨细胞的能力；hFOB 1.19细胞提供了一个同质化的快速增殖模型系统，用于研究正常人造骨细胞的分化、造骨细胞生理和激素、生长因子和对造骨细胞的功能及分化有影响的细胞因子。
人SV40转染成骨细胞（hFOB 1.19细胞）
人SV40转染成骨细胞（HFOB1.19）培养步骤
培养基及培养冻存条件准备：
1）准备DMEM/F12培养基；优质胎牛血清，10%；添加0.3mg/mL G418；双抗，1%。此细胞对温度比较敏感，换液，传代等处理细胞的时候培养基一定要34度预热后使用。
2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：34摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。
3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。
细胞处理：
1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。
4.收到细胞后首次传代推荐将细胞悬液按1：2的比例分到新的含6ml培养基的新皿中或者瓶中，建议客户冻存一支备用，后续传代根据实际情况按1:2到1:5的比例进行。
3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。
应用[4][5]
用于抗菌骨修复材料HAPw/nmZnO-nmCaO生物学性能研究
通过溶胶-凝胶法对HAPw进行改性,制备HAPw/nmZnO-nmCaO复合材料,进一步研究该材料对人SV40转染成骨细胞和小鼠胚胎成纤维细胞细胞毒性及增值影响,旨在了解该材料的生物学性能。
方法：①采用硝酸钙和硝酸锌为原料,PEG6000为分散剂,通过溶胶-凝胶法对HAPw进行改性,再制备成HAPw/nmZnO-nmCaO的复合生物材料,用XRD、SEM进行检测;
②以体外培养人SV40转染成骨细胞和小鼠胚胎成纤维细胞为实验模型,取对数期生长良好的人SV40转染成骨细胞和小鼠胚胎成纤维细胞,给予不同浓度HAPw/nmZnO-nmCaO（0、0.1、1、10mg/ml）作用24h、48h、72h后,采用CCK-8法观察人SV40转染成骨细胞和小鼠胚胎成纤维细胞增殖能力,测定OD值;
③用微量酶标法检测HAPw/nmZnO-nmCaO对人SV40转染成骨细胞ALP活性表达的影响,用实时荧光定量PCR法检测HAPw/nmZnO-nmCaO对人SV40转染成骨细胞的Runx2、TGF-βmRNA的表达变化。
结果：①在的改性工艺下,改性材料的衍射图谱上除了主相羟基磷灰石以外,还出现了CaO和ZnO的特征峰,且不影响主相羟基磷灰石的峰位;
②不同浓度HAPw/nmZnO-nmCaO（0、0.1、1、10mg/ml）作用于人SV40转染成骨细胞和小鼠胚胎成纤维细胞24h、48h、72h,小鼠胚胎成纤维细胞、人SV40转染成骨细胞数量明显增加,各组OD值均增加,浓度在10mg/ml增殖最明显。实验组与空白对照组比较,有统计学意义（P<0.05）,实验组与实验对照组比较,无明显统计学差异（P>0.05）。
③不同浓度的HAPw/nmZnO-nmCaO（0、0.1、1、10mg/ml）作用于人SV40转染成骨细胞72小时后与对照组相比,各个组别HAPw/nmZnO-nmCaO均能够促进ALP活性的表达,且具有统计学差异（P<0.05）,不同浓度的HAPw/nmZnO-nmCaO（0、0.1、1、10mg/ml）作用于人SV40转染成骨细胞72h后,用实时荧光定量PCR法检测,结果显示人SV40转染成骨细胞的Runx2、TGF-βmRNA的表达相对增加,浓度在10mg/ml基因表达增加明显,对照组与实验组间有统计学差异（P<0.05）。
结论：①采用硝酸钙和硝酸锌为原料,PEG6000为分散剂,通过溶胶-凝胶法对HAPw进行改性,成功制备出抗菌骨修复材料（HAPw/nmZnO-nmCaO）。
②HAPw/nmZnO-nmCaO对人SV40转染成骨细胞、小鼠胚胎成纤维细胞没有毒性,可促进它们的增殖。
③HAPw/nmZnO-nmCaO可促进人SV40转染成骨细胞ALP活性的表达,具有促进成骨作用,该材料可能通过增加人SV40转染成骨细胞Runx2、TGF-βmRNA表达水平来促进骨形成。
参考文献
[1]A Review:Molecular Aberrations within Hippo Signaling in Bone and Soft Tissue Sarcomas[J].Michael D Deel,Michael D Deel,Jenny J Li,Lisa E.S.Crose,Corinne M Linardic,Corinne M Linardic,Corinne M Linardic.Frontiers in Oncology.2015
[2]Studies of polylactide/zinc oxide nanocomposites:influence of surface treatment on zinc oxide antibacterial activities in textile nanocomposites[J].Awa SoronféDoumbia,HervéVezin,Manuela Ferreira,Christine Campagne,Eric Devaux.J.Appl.Polym.Sci..2015(17)
[3]Bacterial cellulose-titanium dioxide nanocomposites:nanostructural characteristics,antibacterial mechanism,and biocompatibility[J].Shaukat Khan,Mazhar Ul-Islam,Waleed Ahmad Khattak,Muhammad Wajid Ullah,Joong Kon Park.Cellulose.2015(1)
[4]The Bone Resorption Inhibitors Odanacatib and Alendronate Affect Post-Osteoclastic Events Differently in Ovariectomized Rabbits[J].Pia Rosgaard Jensen,Thomas Levin Andersen,Brenda L.Pennypacker,Le T.Duong,Jean-Marie Delaissé.Calcified Tissue International.2014(2)
[5]赵强.抗菌骨修复材料HAPw/nmZnO-nmCaO生物学性能研究[D].昆明医科大学,2018.