背景及概述
通关藤Marsdenia ten acissima(Roxb.)Wight et Arn.系萝科(Asclepiadaceae)牛奶菜属(MarsdeniaR. Brown)植物，又名通光藤、通光散、乌骨藤和下奶藤等。主产云南，始载于《滇南本草》，兰茂谓:“奶浆藤又名通光藤，茎心有白奶浆流出，味苦、涩，性寒。主治通乳、利尿、清火”。药理研究表明，通关藤除了具有平喘、免疫调节、戒毒等作用，还具有良好的抗癌活性，其水提取物制剂消癌平片及注射液已在临床中应用，是一种很有前途的抗癌药物。通关藤富含C21甾体衍生物(主要是C21甾体的糖苷)和多糖，还含有少量生物碱及树脂等，其中C21甾体糖苷是通关藤抗炎、抗肿瘤及抗生育活性的物质基础。
通关藤苷G提取与分离
方法一、
通关藤茎10kg，粉碎，加水煎煮2h，收集煎煮液，减压浓缩至2L，用等量醋酸乙酯萃取4次，回收溶剂，得醋酸乙酯萃取物260g;水相用等量正丁醇萃取4次，回收溶剂，得正丁醇萃取物280g。醋酸乙酯提取物上硅胶柱色谱分离，以石油醚-丙酮(50∶1)开始梯度洗脱，共得到A～L12个部分。E段上硅胶柱(200～300目)，分EA～EC3部分，EB继续上硅胶柱(CHCl3-Me2CO)，分两部分，EBA上SephadexLH-20得通关藤苷G[1]。
方法二、
药材8公斤，用85％乙醇回流提取3次(4h，3h，3h)，提取液浓缩至无醇，用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，得到石油醚部分浸膏55克，乙酸乙酯部分浸膏240克，正丁醇部分浸膏360克和水部分浸膏714克。乙酸乙酯部位浸膏采用硅胶柱层析，氯仿-甲醇系统梯度洗脱，洗脱流份再次经硅胶柱层析、凝胶柱层析及反相柱层析分离得到通关藤苷G。
通关藤苷G含量测定
方法一、
色谱条件
色谱柱:SymmetryC18柱(250mm×4．6mm，5μm);流动相:乙腈－0．1%磷酸溶液(55∶45，V/V);检测波长:230nm;流速:1mL/min;柱温:25℃;进样量:20μL。
溶液制备
供试品溶液:取消癌平片，去除糖衣，研细，取0．55g，精密称定，置分液漏斗中，加入三氯甲烷6mL、水24mL，摇匀，静置，取有机层，连续萃取3次，将所制得溶液蒸干，用甲醇复溶，并定容至10mL，经0．22μm微膜滤过，取续滤液，即得。
对照品溶液:称取通关藤苷G对照品13．4mg，精密称定，置10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，得通关藤苷G质量浓度为1．34mg/mL的对照品溶液。
方法学考察
专属性考察:取对照品溶液适量，用甲醇稀释，制成通关藤苷G质量浓度为67μg/mL的对照品溶液。按拟订色谱条件进样对照品溶液、供试品溶液及阴性对照品(甲醇)溶液进行分析，色谱图见图1。
1．通关藤苷G
A．对照品溶液B．供试品溶液
C．阴性对照品溶液
图1高效液相色谱图
线性关系考察:精密量取对照品溶液，用甲醇稀释成系列质量浓度(2，4，8，20，40，60，80，100μg/mL)的对照品溶液，按拟订色谱条件进样分析，记录色谱图。以通关藤苷G色谱峰面积(Y)为纵坐标、质量浓度(X)为横坐标进行线性回归，得回归方程Y=5×106X－6048，r=0．9995(n=8)。结果表明，通关藤苷G质量浓度在2～100μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。
精密度试验:取对照品溶液适量，加甲醇制成通关藤苷G低、中、高质量浓度(20．0，40．0，60．0μg/mL)的对照品溶液，各分别重复进样6次，记录峰面积。结果的ＲSD分别为0．76%，1．71%，1．27%(n=6)，表明仪器精密度良好。
稳定性试验:室温下取供试品(样品批号为20150301)溶液，分别于0，1，3，6，9，12，24h时进样测定，记录峰面积。结果的ＲSD为0．82%(n=7)，表明室温下供试品溶液在24h内稳定。
重复性试验:取同批(批号为20150301)样品粉末，6份，按2．2项下方法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定。结果的ＲSD为1．84%(n=6)，表明方法重复性良好。
方法二、
色谱条件：色谱柱为WatersSunFireC18(250mm×4.6mm，5μm)；流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液(45∶55)；流速1.0ml/min；检测波长为230nm；柱温25℃；进样量20μl。
对照品溶液的制备：取通关藤苷G对照品14.02mg，精密称定，置50ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制成每1ml含0.2804mg通关藤苷G的对照品贮备液，精密量取对照品贮备液2ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得。
供试品溶液的制备：取正交试验条件下的干浸膏适量，蒸干后研细，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，超声处理(功率700W，频率40kHz)30min后取出，待冷却后称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤液过0.45μm微孔滤膜，即得。
阴性对照溶液：取缺通关藤的本品处方，得阴性对照溶液。
系统适用性试验：取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各20μl进样，按色谱条件测定，结果通关藤苷G分离效果良好，其他成分对测定无干扰，专属性较好。
线性范围考察：精密吸取对照品储备液 1、2、3、4、5、6 ml，分别置 10 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得系列对照品溶液，按色谱条件，测定峰面积。以通关藤苷 G 进样量(μg)为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，进行线性回归，得回归方程 Y＝84.665X－0.110 7，r＝0.999 6，结果表明通关藤苷 G 在 0.560 8～3.364 8 μg 范围内呈良好的线性关系。
精密度试验：精密吸取通关藤苷 G 对照品溶液，按色谱条件，连续进样 6 次，计算峰面积的 RSD 值为 0.53%，表明仪器精密度良好。
重复性试验：取同一批药材，制备供试品 6 份，并测定峰面积，以通关藤苷 G 含量计算 RSD 为 0.98%，表明试验重复性良好。
参考文献
[1] 陈纪军，张壮鑫，张润珍等．裂冠牛奶菜的化学成分．云南植物研究，1990，12(1)：931．