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L-鼠李糖的检测

发布日期:2019/1/4 11:12:44

背景及概述[1][2]

甘露糖六位的一个羟基被氢取代而衍生的一种单糖,称为L-鼠李糖(Rhamnose),又称鼠李糖、甲基戊糖,L-鼠李糖的纯品为无色粉末,呈结晶状,自然界里主要存在于植物多糖、糖苷、植物胶及细菌多糖中,多为L 型。其甜度是蔗糖的33%,可用于生产香精香料,可食用;可以作为药物的中间体、合成强心药物;可与其他物质反应形成风味物质、用作甜味剂;可用于农作物疾病的防治;还可作为肠道渗透测试剂使用,并具有明显的抗癌作用。

L-鼠李糖可以在植物中提取,也可以用发酵法等途径进行工业生产。L-鼠李糖可以在植物中提取,也可以用发酵法等途径进行工业生产。分子式C6H12O5。脱氧己醛糖的一种,即6-脱-氧L-甘露糖。植物细胞壁和多种糖苷中的成分。α式:无色晶体。自水溶液中结晶者为含结晶水的晶体。熔点105℃。溶于水和甲醇。有旋光活性和变旋现象。在海洋浮游生物中的丰度一般大于阿拉伯糖。也存在于海水、颗粒物和沉积物中。可呈游离或结合的形式存在。

结构

应用[3]

L-鼠李糖不仅可以作为医学检测试剂,又能够作为食品添加剂用于高档咖啡、饮料、面包、肉制品等的加工过程中。目前鼠李糖在工业生产和科学研究中已得到了较为广泛的应用。

制备 [1]

1. 植物中L-鼠李糖的提取

在自然界中,由于L-鼠李糖多存在于植物和细菌中,故可利用植物资源提取L-鼠李糖。在穿龙薯蓣皂甙酸解液中提取L-鼠李糖所选方法为醇提取联合高压酸解法。

具体操作为:取新鲜穿龙薯蓣100 g,研磨并过筛后离心15 min,加醇提取所得离心沉淀2次,合并提取液,水浴蒸馏,溶剂回收,剩余馏渣即皂甙粗提物;60 ℃干燥至恒重后,于0.14 MPa 下将其加适量酸水解一定时间,过滤;滤液添加Ca(OH)2中和至中性或偏酸性,脱色并过滤,添加酵母培养数小时,跟踪测定葡萄糖至耗尽,发酵终止;过滤除去酵母及部分杂质,测定滤液的L-鼠李糖含量,计算L-鼠李糖得率;滤液浓缩后用乙醇重结晶,得L-鼠李糖晶体,最终L-鼠李糖得率最高为0.196%。

以盾叶薯蓣(黄姜)为原料,从皂苷酸解液中提取出L-鼠李糖。粉碎干黄姜,研磨后过筛,精密称取10 g,萃取剂选用体积分数30%的乙醇,与适量的十二烷基硫酸钠混合均匀。试验条件:黄姜和乙醇的质量比是1∶10,25.8 kHz为超声波频率,超声40 min,对总皂苷进行提取,抽滤后浓缩滤液,加入浓度为1.5 mol /L 的硫酸20 ml,于电热套内水解4h,完毕后抽滤,滤渣冲洗至中性后烘干,可于索氏提取器内提取制备皂苷元,滤液即为酸解液,向酸解液中加入Ca(OH)2调节pH 至中性或者偏酸性,过滤除去CaSO4沉淀,于滤液中加入活性炭进行脱色,过滤除去色素,得到无明显颜色的滤液。

然后加入2% 的活化酵母,36 ℃恒温发酵,用薄层色谱法跟踪测定葡萄糖,待其耗尽即可终止发酵,过滤除去杂质,将滤液进行L-鼠李糖含量测定并计算得率。滤液浓缩后用甲醇重结晶,可得L-鼠李糖晶体,最终L-鼠李糖得率最高为1.5%。

2. 生物酶解法制备

L-鼠李糖L-鼠李糖多从天然植物中获得,如从橡树皮中提取栎皮酮,通过水解得到含L-鼠李糖的溶液,经分离提纯获得L-鼠李糖纯品。此类生产方法有一定缺点,如劳动强度大,分离提纯过程中易生成有毒物质,原材料受季节、地域及运输等因素影响。作为方法改进,利用微生物所产的芦丁α-L-鼠李糖苷酶酶解制备L-鼠李糖。

试验前期已筛选出一种芦丁α-L-鼠李糖苷酶,该酶能特异性水解芦丁上的L-鼠李糖苷键,生成异槲皮苷和L-鼠李糖。取芦丁24.0 g 酶解,产物用大孔吸附树脂分离,得L-鼠李糖粗糖液4.18 g,产率为17. 4%。基于结晶法对L-鼠李糖粗糖液精制,在L-鼠李糖水溶液质量浓度0.4 g /ml 时,溶液达到过饱和状态并开始结晶,得无色透明结晶,产率为27.5%。经高效液相色谱检测,L-鼠李糖纯度高达99.0%。研究可为生物转化法大量生产L-鼠李糖提供研究依据,生物酶法因其具有水解特异性好、环境友好等特点,为L-鼠李糖的制备提供了新的思路。

3. 微生物发酵制备

L-鼠李糖利用微生物生产含有L-鼠李糖的L-鼠李糖脂是大规模生产L-鼠李糖较有发展前景的方法。发酵法生产L-鼠李糖较常选用假单孢菌,其中铜绿假单孢菌最为常用。培养的碳源、氮源、无机离子种类及浓度变化,均会影响L-鼠李糖脂的生物合成,有些碳源适于糖脂的形成。在微生物发酵法制备L-鼠李糖的条件对比研究中,选取糠油为碳源,利用假单胞菌发酵制备L-鼠李糖脂,水解后分离得L-鼠李糖。

也可利用再生材料制备L-鼠李糖脂,水解后得L-鼠李糖。虽然生产L-鼠李糖脂的原料一直来源很广,从石油化学衍生的物质到天然原料,最常用的是植物油、糖和甘油。现已证明,许多废弃物也可能用于生产L-鼠李糖脂,如脂肪酸、废煎炸油、橄榄油的生产废水、乳清废物。总结了“传统的”生产L-鼠李糖脂的可再生原料:糖、油、甘油及潜在的可利用废弃物。

总结了对下一代产L-鼠李糖脂菌种的要求,如下:扩大原料谱,增加代谢谱,减少副产物的形成和更易控制。如果能达到这点,L-鼠李糖脂的规模化生产在经济上是可行的,并且在不远的将来,可能在商业水平上获得成功。L-鼠李糖可由L-鼠李糖脂水解制备。碱法水解可用1mol /L NaOH 40 ℃ 回流12 h,酸法水解可用1 mol /L HCl 回流2.5 h,或者在30 ~ 100 ℃ 加H2SO4水解。

L-鼠李糖脂水解后得到L-鼠李糖和3-羟基酸,可用乙酸乙酯萃取3-羟基酸,L-鼠李糖在水层;也可用离子交换法,调pH > 5,用阴离子柱分离3-羟基酸;还可用层析法分离L-鼠李糖。经大量实践后,工业化生产选用发酵法为L-鼠李糖的主要制备方法。生产的L-鼠李糖依据中间产物的不同可分为2 类:一类为由微生物或藻类生产含L-鼠李糖基的多糖,水解获得L-鼠李糖;另一类为利用微生物生产L-鼠李糖脂,水解L-鼠李糖脂得到L-鼠李糖。

然而,该法在制备L-鼠李糖过程中明显存在不足: L-鼠李糖在多糖中含量往往偏低,水解后含有其他单糖,为后期分离提取增加难度和成本;发酵液中时常混有杂蛋白,为多糖的分离提纯增加困难;多糖易受本身性质影响,如用发酵液黏度过高,工艺条件不易操控等。因此,利用微生物生产L-鼠李糖脂后经水解制备L-鼠李糖是大规模生产L-鼠李糖较有发展前景的方法。

检测[1]

L-鼠李糖是单糖,故其含量检测方法可参照其他单糖的测定方法。单糖通常用二硝基水杨酸法(DNS 法)、高效液相色谱法、毛细管柱气相色谱法和薄层色谱法等方法进行含量测定。

1. 二硝基水杨酸法(DNS 法)

二硝基水杨酸法是依据二硝基水杨酸在碱性条件下与还原糖发生氧化还原反应生成产物在煮沸条件下实现棕红色,再用比色法测定还原糖含量的一种检测方法。因为糖类游离出还原基团的数量可决定其显色的深浅,并对还原糖的种类无选择性,故DNS 法广泛应用于多糖等水解后生产多种还原糖体系中。

选取盾叶薯蓣为原料研究了从皂苷酸解液中提取L-鼠李糖的工艺。在提取出L-鼠李糖后,采用DNS法进行L-鼠李糖含量的测定,并建立标准曲线,得出回归方程,利用得率公式:得率(%) = L-鼠李糖质量/盾叶薯蓣原料质量× 100%进行含量计算。测定结果为,盾叶薯蓣总还原糖的得率为2.19%,L-鼠李糖得率为1.5%。

2. 高效液相色谱法

高效液相色谱法(HPLC)是色谱法的一个重要分支,选取液体为流动相,利用高压输液系统,将不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱,各组分在柱内分离后进入检测器检测,以实现试样的分析。该法在化工、医药、工业、农业及商品检验检疫领域中起到重要作用。高效液相色谱法在单糖及多糖检测中起到重要作用。

在《国外医学临床生物化学与检验学分册》中曾刊登出《HPLC 法定量测定尿中L-鼠李糖、甘露醇及乳果糖评估小肠通透性在儿科的应用》一文,文中介绍作者采用了示差高压液相色谱法,以乳果糖为大分子探针糖,甘露醇和L-鼠李糖为小分子探针糖,研究14 名健康儿童在14 d内无胃肠道症状,禁食一夜后收集试验前尿样。

随后,每人口服100 ml 含5 g 乳果糖、l g L-鼠李糖和1 g 甘露醇的溶液,收集5 h 内的尿样,记录总体积,取20 ml 尿液置- 20 ℃冻存至分析。试验以HPLC 柱为氨基修饰的硅胶柱,流动相为乙睛∶水(70∶30,V/V),流速为1 ml /min,LC 1240 折射率示差检测。结果得出L-鼠李糖保留时间为6.2 min,最低检出浓度为0.1 mmol /L。

3. 薄层色谱法

薄层色谱法(TLC)又称薄层层析法,是对少量物质进行快速分离、定性分析的一种很重要的实验技术。是在玻璃板、塑料或铝基片上涂抹一层薄厚均匀的固定相,点样后展开,将比移值(Rf) 与适宜的对照物的比移值(Rf)比较,进行药物鉴定、检查杂质或测定含量。据报道,采用薄层层析法对黄姜中的L-鼠李糖进行提取并定性分析。

从皂苷酸解液提取L-鼠李糖时,采用此法定性分析,薄层色谱条件为:展开剂为V(乙酸乙酯)∶V(甲醇)∶V(醋酸)∶V(水)=60∶15∶15∶10;显色剂为10%硫酸乙醇溶液;Rf 值为0.76,斑点为圆形且无拖尾;喷湿润后于100 ℃烘烤10 min,得到L-鼠李糖斑点,与标准品斑点一致。

4. 其他检测方法

由于L-鼠李糖属于单糖、水溶性还原糖,因此可参考其他类似糖类的检测方法。目前国内对食品中糖含量的检测多采用化学检测法、高效液相色谱- 荧光检测法、离子色谱法、毛细管柱气相色谱法、流动注射分光度法等。

主要参考资料

[1] 高旭东, 郝宝成, 梁剑平, 等. L-鼠李糖的制备及检测方法研究进展[J]. 安徽农业科学, 2014, 42(18): 5966-5968.

[2] 李玉山. 芦丁水解液发酵法制备 L 一鼠李糖的工艺[J]. 食品与生物技术学报, 2009, 28(4): 532-534.

[3] 魏胜华, 孟娜, 李婉珍, 等. 两步生物法转化柚皮苷制备 L-鼠李糖[J]. 精细化工, 2011, 28(12): 1178-1182.

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