背景及概述[1][2]
系统名“1-甲基-4-酮-2-亚胺基咪唑啉”。分子式C4H7N3O。分子量113.12。由水中得叶片状晶体或二水合正交棱晶体。溶于热水，微溶于乙醇，不溶于丙酮、乙醚、氯仿等。为尿、肌肉等的组成部分，在机体内主要以磷酸肌酸的形式存在，游离肌酸酐很少。加热至250℃变焦黄，295℃完全分解。紫外线下能发光。与次溴酸钠溶液反应24小时放出1mol氮。与浓磷酸于150℃加热放出1mol氮，230℃时放出所有氮。
与过量苯甲醛或1mol亚苄基苯胺于150℃加热得5-亚苄基肌酸酐，与3-硝基苯甲醛和香兰素均有类似反应。与氢氧化钡水溶液和硝酸银共热氧化为甲基胍，与碱性高锰酸钾或氧化汞反应得甲基胍和草酸。与0.7%苏打溶液反应消除氨得到1-甲基乙内酰脲，并能被苦味酸和苦味酸钾定量分解。制法：由肌酸与90%乙酸或氯化锌共沸，或由肌氨酸乙酯与胍在-15℃或与氰基氨于室温下反应而制得。用途：作生化研究试剂。
肌酸酐是磷酸肌酸代谢的产物，其化学结构是肌酸通过脱水缩合形成的内酰胺。肌酸酐一般存在于血液中，通过血液循环到达肾脏并被过滤掉。对于肾功能正常的人群来说，血液 中的肌酸酐浓度因人因地而异。一般而言，在无大体力负担的情况下，女性的血液中的肌酸 酐浓度在45-60μM；男性的血液肌酸酐浓度在60-110μM的范围内浮动。
检测[2]
肌酸酐的测量比较困难。目前常用的方法是质谱法（同位素稀释质谱法）、高效液相色谱 法、液相色谱-质谱连用法以及抗体检测（ELISA），这些方法一般都需要昂贵的仪器，如质谱仪、液相色谱仪或酶标仪等，以及受过系统训练的分析化学操作人员的操作，极大地提高肌 酸酐测量的经济成本和时间成本，以及肌酸酐测量在边远地区的应用。
质谱法通过在样品中人为加入含有某种同位素（如O-18）的肌酸酐并对此样品进行质谱 分析。比对质谱结果中O-18的丰度和O-18在自然界中的丰度即可计算出肌酸酐的浓度。人 为加入的肌酸酐可以严格控制，作为一种内标准（internalcalibration），这种方法可以有 效的降低误差。
根据最新研究，用质谱法得到的肌酸酐浓度偏低，这将在临床上引起一系列问题，美国FDA也开始考虑新的肌酸酐检测手段。液相色谱法是在质谱的基础上使用高效液相色谱对样品进行纯化并用质谱进行检测。质 谱法和液相色谱法无法自动化、操作复杂，并且需要分析团队对仪器进行操作和维护，而ELISA 法需要使用价格昂贵的酶标仪，虽然其灵敏度极高，但是选择性较差，经常会高估肌酸酐的浓度，导致临床用药的过量或不足。
CN201310363461.0提供一种选择性高、灵敏度高和使用方便 的肌酸酐含量检测试剂和试剂盒，及试剂盒的制作和使用方法。通过以下技术方案实现的：
一种肌酸酐含量检测试剂，包括肌酸酐酶、肌酸酶、肌氨酸氧化酶和辣根过氧化物酶， 荧光染料5（6）-羧基-2,7-二氯二氢荧光素二特戊酸酯，肌酸酐在肌酸酐酶的催化下被水解成为肌酸，肌酸在肌酸酶的催化下被水解成肌氨酸，肌氨酸随之在肌氨酸氧化酶的催化下生成甘氨酸以及少量的过氧化氢。
在辣根氧化物酶的催化下，过氧化氢催化氧化了5（6）-羧基-2,7-二氯二氢荧光素二特戊酸酯并生成具有荧光响应的产物，通过监测荧光增强的速率以及标准曲线，获得肌酸酐浓度，其中所述肌酸酐酶：肌酸酶：肌氨酸氧化酶：辣根过氧化物酶：荧光染料的重量比为：1：50：60：5。而且，包括如下三层结构：
⑴染料底层：将荧光染料修饰过的纤维素和D4水凝胶混合并搅拌，在一张干净的塑料 薄膜上用刮刀涂膜机涂上一层D4水凝胶的薄膜并使之自然风干；
⑵蛋白酶固定层：在PVA-Sbq（聚丙烯醇-苯基吡啶乙烯络合物）的水溶液中加入10%的牛血清蛋白以及反应所需的肌酸酐酶、肌酸酶、肌氨酸氧化酶和辣根过氧化物酶，搅拌25-40 分钟以上，用刮刀涂膜机涂上一层酶的PVA-Sbq溶液，将紫外灯置于膜层的上方30分钟，使苯基吡啶乙烯交联并使膜层变干；
⑶顶层保护层：最后在上面用刮刀涂膜机涂上一层含有10%炭黑的D6水凝胶，并使膜 层自然风干。
而且，三层结构的具体制备步骤如下：
⑴将176mg纤维素固定的5（6）-羧基-2,7-二氯二氢荧光素二特戊酸酯和2.6g的4%D4 水凝胶溶液混合并搅拌均匀，使纤维素粉末在溶液中均匀分散；
⑵将步骤⑴中所制备的溶液均匀在塑料薄膜上使之形成一层厚度为100uM的薄膜并晾 干；
⑶将30mg肌酸酶、35mg辣根过氧化物酶、0.63mg肌酸酐酶、2.6mg肌氨酸氧化酶、340mg水和1.33g浓度为10%并含有10%牛血清蛋白的PVA-Sbq溶液混合，并在冰上搅拌 均匀；
⑷在步骤⑵中制备的薄膜上涂上步骤⑶中所制备的PVA-Sbq/酶溶液，膜层的厚度为100 μm，将薄膜置于紫外灯下30分钟；
⑸在步骤⑷中所制备的薄膜上涂上一层含有6%炭黑和1.8%D6的溶液并自然风干。
肌酸酐含量检测试剂盒，包括上述的检测试剂。制备方法步骤如下：
⑴将176mg纤维素固定的5（6）-羧基-2,7-二氯二氢荧光素二特戊酸酯和2.6g的4%D4 水凝胶溶液混合并搅拌均匀，使纤维素粉末在溶液中均匀分散；
⑵将步骤⑴中所制备的溶液均匀在塑料薄膜上使之形成一层厚度为100uM的薄膜并晾干；
⑶将30mg肌酸酶、35mg辣根过氧化物酶、0.63mg肌酸酐酶、2.6mg肌氨酸氧化酶、 340mg水和1.33g浓度为10%并含有10%牛血清蛋白的PVA-Sbq溶液混合，并在冰上搅拌 均匀；
⑷在步骤⑵中制备的薄膜上涂上步骤⑶中所制备的PVA-Sbq/酶溶液，膜层的厚度为100 μm，将薄膜置于紫外灯下30分钟；
⑸在步骤⑷中所制备的薄膜上涂上一层含有6%炭黑和1.8%D6的溶液并自然风干。
试剂盒的使用方法，其特征在于：在含有100mMHEPES，150mM氯化钠，5mM 氯化钾，1.3mM氯化钙的缓冲液中，pH7.3，加入不同浓度肌酸酐，用毛细管两驱150μL 的样品溶液并安插在试剂盒上并用荧光仪开始测量。
图2为本发明肌酸酐传感器使用的试剂盒的结构；
主要参考资料
[1] 化合物词典
[2] CN201310363461.0 一种三层结构的肌酸酐含量检测试剂的制备方法