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Α-葡糖苷酶的应用

发布日期:2020/1/15 8:42:37

背景及概述

Α-葡糖苷酶即α-葡糖苷酶

检测方法[1]

CN201711044672.2提供一种精浆中性α-葡糖苷酶检测试剂盒,该试剂盒组分简单,没有终止液,在检测精浆中性α-葡糖苷酶时,检测速度快,时间 短,线性范围宽,结果的准确度和精密度高。其特征在于,包括R1试剂、R2试剂和非定值质控品;所述R1试剂为包含十二烷基硫酸钠(SDS)的磷酸盐缓冲液;所述的R2试剂为包含尿素、水杨酸钠和4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)的磷酸盐缓冲液;所述非定值质控品为精浆冻干粉。

检测步骤为

(1)样本准备:手淫法采集禁欲2~7天的精液于采样杯中,置37℃水浴箱中液化, 3000~12000rpm离心5~10min分离精浆,即刻用于检测;试剂盒准备:试剂盒从2~8℃取出 后,于室温下平衡30~35min,然后R1再于35~37℃放置5~10min,使R1溶液变澄清,即可上 机检测;

(2)设置全自动生化分析仪的主、副波长分别为400~420nm、600~700nm,R1/样 本/R2加样量的体积比为15︰1︰15,范围为(75~151μl)︰(5~10.1μl)︰(75~151μl)。

(3)检测方法:速率法,加入R1和样本后混匀,37℃孵育4~6min;加入R2后混匀,37 ℃孵育2~5min;连续测定2~5min内的吸光度,仪器计算吸光度变化率△A/min,具体过程见表1;

表1精浆中性α-葡糖苷酶检测流程

(4)计算样本中中性α-葡糖苷酶活性;

(5)取纯化水复溶非定值质控品,通常取2~5mL纯化水复溶冻干前4mL/瓶非定值质控品,混匀后,分装成300μL/支,-25~-20℃保存;每天取出一支复溶,用试剂盒检测此复溶的非定值质控品(检测方法和仪器的设定同上述样品的检测),重复检测5-20天,每天重复5-10次,将检测结果进行统计分析,求平均值和标准差(s),以为质控线绘制质控图;此后将质控品随着样本一起检测(检测方法与上述相同),根据质控品的检测结果是否在质控线内判断样本检测结果是否在控。其中,步骤(4)所述中性α-葡糖苷酶活性的计算公式为(U/L)=△A/min×F,其中

F:相应全自动生化分析仪上的理论因子;

VT:试剂针和样本针吸取的R1试剂、R2试剂和样本的体积之和,单位:μl;

ε:摩尔吸光系数,单位:L/(mol·cm);

l:光径,单位:cm;

Vs:样本体积,单位:μl;

△A/min通过全自动生化分析仪自动测定样本得到。

有益效果:与现有技术相比,本发明具有如下优点:

(1)本发明提供一种与全自动生化分析仪配套使用的检测精浆中性α-葡糖苷酶的 试剂盒,试剂盒组分简单,没有终止液,生产和使用都相对简单;在检测精浆中性α-葡糖苷 酶时,反应时间约为5min,单个样本检测时间需要10-15min,需要试剂量和样本量少,线性范围宽,结果的准确度和精密度高,同时可与精浆生化的其他项目联检。

(2)该试剂盒在全自动生化分析仪上配套使用,通过反应曲线的变化监测整个反 应过程;使用速率法,通过监测吸光度的变化率计算酶的活性,样本的检测结果由仪器直接 给出,不需要做标准曲线;通过质控品的检测可以反映检测系统的稳定性和检测结果的准 确性,同时可与精浆生化的其他项目联检。

(3)本发明的试剂盒中含有尿素和水杨酸钠可以有效地提高整个试剂盒的准确度和重复性。

应用 [2]

用于治疗庞贝氏病。

庞贝氏病的发病率被估计为在40,000人中约1例,并且是由GAA基因的突变引起 的,该GAA基因编码溶酶体的α-葡糖苷酶(EC:3.2.1.20),该酶也常被称为酸性α-葡糖苷酶。酸性α-葡糖苷酶通过在溶酶体内将糖原催化水解为葡萄糖,参与糖原(一种分枝的聚糖,是动物中葡萄糖的主要储存形式)的代谢。因为患有庞贝氏病的个体产生的突变的、缺陷的酸 性α-葡糖苷酶是非活性的或具有减少的活性,糖原分解发生缓慢或一点也不分解,并且糖原累积在不同组织的溶酶体中(特别是在横纹肌中),导致了包括进行性肌无力和呼吸功能不全的广谱临床表现。组织(例如,心脏和骨骼肌)是特别受影响的。CN201680077801.5提供了一种用于在对其有需要的患者中治疗庞贝氏病的方法,该方法包括将麦格司他与重组人酸性α-葡糖苷酶(rhGAA)组合给予患者,其中该重组人酸性α-葡糖苷酶在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达,并且相比带有阿葡糖苷酶α的一个或两个甘露糖-6- 磷酸残基的N-聚糖单元的含量,该重组人酸性α-葡糖苷酶包括含量增加的带有一个或两个甘露糖-6-磷酸残基的N-聚糖单元。在至少一个实施例中,将该重组人酸性α-葡糖苷酶以约 20mg/kg的剂量实施静脉给予,并且将麦格司他以约260mg的剂量口服给予。

主要参考资料

[1] CN201711044672.2 一种精浆中性α?葡糖苷酶检测试剂盒及其应用

[2] CN201680077801.5 用于治疗庞贝氏病的增强的酸性α-葡糖苷酶

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