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碱性磷酸酯酶的结构

发布日期:2019/2/2 11:49:31

背景及概述[1][2]

磷酸酯酶是水解磷酯类的酶。分布甚广,种类很多。根据作用时所需氢离子浓度值的不同,可分为碱性磷酸酯酶和酸性磷酸酯酶两类。血浆中磷酸酯酶的测定,常用于某些疾病如肝病的临床诊断。碱性磷酸酯酶是催化从单链或双链DNA和RNA分子中除去5-磷酸残基,即脱磷酸作用。1977年,从细菌和小牛肠道中分离得到细菌碱性磷酸酯酶(简称BAP)和小牛肠碱性磷酸酯酶(CIP)。在基因工程中主要是应用该酶处理经限制性内切酶切割后的载体DNA,去除载体DNA两末端的5-磷酸残基,以防止载体DNA自我环化,从而提高其重组效率。同时,在用同位素32P标记5-OH末端以制备DNA或RNA探针时,先用该酶去除5-磷酸基,而产生5-OH末端,再进行末端标记。

结构[3-5]

碱性磷酸酯酶(AP,alkaline phosphatase)是广泛存在于各种生物体内,参与细胞磷代谢和信号肽转导的一种磷酸酶,其最适pH 值在7.0 以上,能够以同样的速率催化许多种磷酸单酯的水解。磷酸盐在细胞内不能合成,当磷酸盐数量受限的时候,细胞必须通过磷酸酯酶的水解从核酸、磷酸化糖和蛋白质中得到有机体所需的磷酸盐。因而AP 的来源广泛,可来源于细菌、真菌、藻类、无脊椎动物及脊椎动物。AP 在酶联免疫标记试验(ELISA)中用作的标记酶,将碱性磷酸酯酶与显色剂或去磷酸化后能发光的底物相互作用来能揭示靶与检测酶复合物的存在。AP 作为非同位素标记被广泛应用于Southern 和Northern 印记分析和DNA 序列分析等各个方面。AP 能催化除去DNA 、RNA、三磷酸核糖核苷和三磷酸脱氧核糖核苷的5′磷酸基团,切除rNTPs 及dNTPs 的5′末端磷酸基团,为5′末端标记准备模板,防止DNA 片段的自连接或克隆载体自环化连接,蛋白质的去磷酸化,蛋白质丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸残基的去磷酸化。用AP 处理后的DNA 片段缺少连接酶所要求的5′磷酸末端,使得它们不能进行自连接,利用这个特性可以降低克隆时载体DNA 的背景。

此外,碱性磷酸酯酶(AP)是广泛存在于各种生物组织中的一种酶。AP的存在浓度与骨骼疾病、肝炎以及前列腺癌等多种疾病的发生密切相关,低碱性磷酸酯酶症(hypophosphatasia,HPP)是一种罕见的常染色体遗传疾病,由于碱性磷酸酯酶基因(alkalinephosphatase gene,ALPL)突变导致的系统性疾病。重症HPP通常为常染色体隐性遗传,而轻度HPP 可以是显性或隐性遗传。其典型症状为骨骼和牙齿矿化不全以及血清碱性磷酸酶(ALP)活性偏低。重症HPP 的发病率在十万分之一左右,轻度HPP则更为常见。HPP 有很多不同程度的临床表现。主要诊断依据是血清ALP 活性检测和分子遗传学检测。该病目前尚无可靠的治疗方法。

另外,碱性磷酸酯酶还广泛用于分析检测中,如用于L苯丙氨酸的分析检测中,步骤如下:(1)将待测样品稀释于TBS缓冲溶液中,制得待测溶液;(2)向待检测溶液中加入碱性磷酸酯酶溶液,经反应,制得酶反应液;(3)将酶反应液滴于十二烷基磷酸酯钠盐溶液修饰的液晶传感器上,使用偏光显微镜进行观察。本发明涉及的基于液晶传感器分析检测苯丙酮尿症患者尿液中L-苯丙氨酸的方法,具有检测限低,检测仪器易得,检测方法简单、快速、灵敏,试剂消耗少,样品处理时间短等优点,解决了现有检测方法复杂、成本高的问题。还有实验利用碱性磷酸酯酶的催化反应触发CdS光电极的光电流,建立了一种免疫反应与光电极分离的、高通量的免疫分析方法。表面沉积了金属氧化物或水合金属氧化物的CdS光电极基本没有光电流信号,而碱性磷酸酯酶的催化水解反应产生的还原剂使金属氧化物或水合金属氧化物分解,从而导致CdS光电极光电流的大幅提高。以小鼠IgG为模型,通过碱性磷酸酯酶标记检测抗体,对在96微孔板里进行的夹心结构免疫反应实现了检测。该方法的最大的优势在于将免疫反应从电极表面分离,避免了电极表面固定的生物分子对光电化学测定的灵敏度和准确度的影响。更为重要的是,微孔板反应的引入以及免疫反应与光电检测的分离大大提高了检测效率。

活力检测 3]

一种基于光活性纳米材料模拟酶的碱性磷酸酯酶活性检测方法,该光活性纳米材料模拟酶可以通过碱性磷酸酯酶的催化反应原位产生;利用碱性磷酸酯酶催化 反应形成的光活性纳米材料模拟酶的高效类酶催化活性实现信号放大,可以方便、灵敏、快速地检测碱性磷酸酯酶活性。技术方案如下:

a、二氧化钛纳米材料的制备:将5mL含钛化合物逐滴加入到75mL超纯水中,混合后的溶液在室温下持续搅拌。然后将上述溶液转移到反应釜内并加热到160℃持续24h。离心获得产物并用超纯水洗涤多次,最后烘干获得白色二氧化钛纳米颗粒;

b、碱性磷酸酶活性的测定:5μmol/L的碱性磷酸酶的底物与10μL不同浓度的碱性磷酸酯酶混合后加入到96微孔板中,室温下反应一段时间;加入10μL 1.5mg/mL的二氧化钛纳米材料反应15min后,加入100μL pH为4.0的0.2mol/L的醋酸缓冲溶液和20μL 5 mmol/L的纳米材料模拟酶的特征底物,放置在氙灯下用可见光(λ≥400nm)照射10min 后,并在酶标仪上测定体系的吸收光谱或荧光光谱。

主要参考资料

[1] 食品生物技术耐热碱性磷酸酯酶的研究进展

[2] CN201811110180.3一种基于液晶传感器的L-苯丙氨酸的分析检测方法

[3] CN201711316296.8 一种基于碱性磷酸酯酶催化反应触发CdS光电流的免疫分析方法

[4] 低碱性磷酸酯酶症研究进展

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