碱性磷酸酶的研究应用

2019/10/24 11:41:40

碱性磷酸酶是广泛分布于人体各脏器器官中,其中以肝脏为最多其次为肾脏,骨骼、肠、和胎盘等组织。这种酶能催化核酸分子脱掉5’磷酸基团,从而使DNA或RNA片段的5’-P末端转换成5’-OH末端。但它不是单一的酶,而是一组同功酶。目前已发现有 AKP1 、AKP2 、AKP3 、AKP4 、AKP5 与 AKP6 六种同功酶。其中第 1 、 2 、 6 种均来自肝脏,第 3 种来自骨细胞,第 4 种产生于胎盘及癌细胞,而第 5 种则来自小肠绒毛上皮与成纤维细胞。血清中的ALP主要来自肝脏和骨骼。生长期儿童血清内的大多数来自成骨细胞和生长中的骨软骨细胞,少量来自肝。

生理特性

碱性磷酸酶是一种能够将对应底物去磷酸化的酶,即通过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去,并生成磷酸根离子和自由的羟基,这类底物包括核酸、蛋白、生物碱等。而该脱去磷酸基团的过程被称为去磷酸化或脱磷酸化。碱性磷酸酶是磷酸酶的一种,磷酸酶的作用与激酶的作用正相反,激酶是磷酸化酶,可以利用能量分子,如ATP,将磷酸基团加到对应底物分子上。碱性磷酸酶在碱性环境有活力,对来源于细菌中的ALP来说,其最适pH是8.0,而对来源于牛的ALP则是8.5。

碱性磷酸酶偏高的原因

当肝脏受到损伤或者障碍时经淋巴道和肝窦进入血液,同时由于肝内胆道胆汁排泄障碍,反流入血而引起血清碱性磷酸酶明显升高。

碱性磷酸酶偏高的原因可以分为生理性原因和病理性原因,具体讨论如下:

1、生理性原因儿童骨骼发育期、孕妇、骨折愈合期,这些情况下骨组织中的碱性磷酸酶很活跃,所以检测时值会偏高。

2、病理性原因当人体患有阻塞性黄疸、原发性肝癌、继发性肝癌、胆汁淤积性肝炎等时,肝细胞过度制造ALP,经淋巴道和肝窦进入血液,同时由于胆汁排泄障碍,反流入血,引起血清中的碱性磷酸酶偏高。

3、骨骼有病时,例如佝偻病、骨上肿瘤、软骨病等。

4、其他不是很常见的疾病,例如肾病、严重性贫血、甲状腺机能不全、白血病等[2]。

有何影响

碱性磷酸酶主要用于阻塞性黄疸、原发性肝癌、继发性肝癌、胆汁淤积性肝炎等的检查。它主要经淋巴道和肝窦进入血液,同时由于肝内胆道胆汁排泄障碍,反流入血而引起血清碱性磷酸酶明显升高。但由于骨组织中此酶亦很活跃。因此,孕妇、骨折愈合期、骨软化症。佝偻病、骨细胞癌、骨质疏松、肝脓肿、肝结核、肝硬变、白血病、甲状腺机能亢进时,血清碱性磷酸酶亦可升高,所以对人体的危害是比较大的。

研究应用

碱性磷酸酶也是目前免疫诊断试剂产品最常用的标记酶之一。与辣根过氧化物酶(HRP)相比,ALP用作标记酶的优点是,稳定性高、灵敏度高,缺点是成本高,标记困难。

在研究中最常用的ALP如下:

细菌碱性磷酸酶Bacterialalkaline phosphatase (BAP), 来源:Escherichia coliC4 ;

Shrimpalkaline phosphatase (SAP), 来源:一种北极虾 (Pandalus borealis) ;

小牛肠碱性磷酸酶CalfIntestinal Alkaline Phosphatase (CIP);

胎盘碱性磷酸酶Placentalalkalinephosphatase (PALP)和分泌性碱性磷酸酶the secreted alkaline phosphatase (SEAP),后者是前者的C末端短缺版——与PALP相比,SEAP没有PALP的C末端最后24个氨基酸(这24个氨基酸构成了与糖基化磷脂酰肌醇靶向锚定的区域)

ALP主要应用于分子生物学和酶免分析中:

分子生物学中主要用作核酸的去磷酸化。因为DNA通常会在5'端结合磷酸基团,用ALP去磷酸化能防止DNA分子5'端与3'端连接,从而在后续步骤准备好之前让DNA分子抑制处于线性化状态;同样,通过去磷酸化可用作放射标记示踪。通常用作这些目的用的最多的是Shrimp alkaline phosphatase (SAP),因为在反应完成之后它是最容易灭活的。

酶免分析中应用最多的是ELISA,以竞争法测小分子抗原为例,抗体先与固相载体结合,然后让待测样品与事先经ALP标记过的该抗原竞争地与抗体结合,洗去未反应的过量ALP-抗原,加入显色底物。则可以通过与按梯度浓度变化的标准品绘出的标准曲线对比从而 知道待测样品中抗原的浓度。ELISA中用的比较多的是辣根过氧化物酶(HRP),底物为OPD,深桔黄色,检测波长492nm;TMB,蓝绿色,检测波长450nm 碱性磷酸酶,底物为PNPP(对-消基苯磷酸酯),黄色,检测波长405nm

目前工业上一个普遍的应用是作为检验牛奶的巴斯的灭菌的标志:被巴斯德过高温灭菌的分子会被灭活,向其中和未巴斯灭菌的牛奶中加入ALP的底物,2分钟后未灭菌的样品应该显黄色,如果待测样品(指被巴斯灭菌过的牛奶)也能呈现相同颜色,则说明巴斯灭菌温度未过度。当然总有例外,因为有少数细菌会产生耐热的ALP。

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