背景[1-3]
人肺腺癌细胞该细胞是从一名25岁的白人男性肺腺癌患者的胸水中分离建立的；该患者曾使用过环磷酰胺、博来霉素、阿霉素进行治疗。该细胞接种至裸鼠可成瘤；可作转染宿主。
人肺腺癌细胞
人肺腺癌细胞培养操作:
1）复苏人肺腺癌细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2）人肺腺癌细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。
4.将人肺腺癌细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
3）人肺腺癌细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为类；
1.人肺腺癌细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。
2.4 min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。
3.将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
应用[4][5]
人肺腺癌细胞可以用于四种穿心莲内酯水溶性衍生物在Caco-2和Calu-3单细胞层模型上的转运研究
建立了Caco-2和Calu-3单细胞层模型,观察四种穿心莲内酯水溶性衍生物在单细胞层模型上的转运过程,预估药物在消化道黏膜和呼吸道黏膜的渗透性。实验逐一建立四种穿心莲内酯水溶性衍生物高效液相色谱含量测定方法,并进行方法学验证,结果表明这些方法适用性好、准确度高,可用干测定穿心莲内酯水溶性衍生物的含量。
采用四甲基偶氮唑盐比色法计算不同浓度穿心莲内酯水溶性衍生物作用24小时后Caco-2细胞株和Calu-3细胞株的存活率,比较其对于两细胞株细胞活性的影响,确定转运实验时的安全给药浓度。
实验结果表明,四种穿心莲内酯水溶性衍生物对于两细胞株的细胞活性均表现为抑制作用,且具有浓度依赖性;四种穿心莲内酯水溶性衍生物对Caco-2细胞株细胞活性的抑制较Calu-3细胞株更大;在给定浓度范围内,四种穿心莲内酯水溶性衍生物安全性由大至小依次为穿心莲内酯总磺化物、亚硫酸氢钠穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯钾钠盐、脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯单钾盐;当浓度低于500μg·L-1时,四种穿心莲内酯水溶性衍生物作用于两细胞株,其存活率均接近甚至高于90%,即0-500μg·mL-1为转运实验时的安全给药浓度。实验成功建立Caco-2和Calu-3单细胞层模型,考察给药浓度、作用时间及P-糖蛋白抑制剂对穿心莲内酯水溶性衍生物转运的影响。
结果表明,四种穿心莲内酯水溶性衍生物在Caco-2单细胞层模型上双侧转运均具有浓度依赖性,转运量随给药浓度升高而增大;穿心莲内酯总磺化物和脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯钾钠盐在Calu-3单细胞层模型上表观渗透系数值较大,呼吸道黏膜渗透性更高,更适合于肺部吸入制剂的开发,亚硫酸氢钠穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯单钾盐在Caco-2单细胞层模型上表观渗透系数值较大,消化道黏膜渗透性更高,更适合于口服给药制剂的开发;添加P-糖蛋白抑制剂后,脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯钾钠盐在Calu-3单细胞层模型上的外排比及亚硫酸氢钠穿心莲内酯在Caco-2单细胞层模型上的外排比均显著降低,即P-糖蛋白参与二者转运过程,故联合应用P-糖蛋白抑制剂可以减少外排,促进吸收,增加渗透性。
参考文献
[1]Andrographolide inhibits hypoxia‐induced HIF‐1α‐driven endothelin 1 secretion by activating Nrf2/HO‐1 and promoting the expression of prolyl hydroxylases 2/3 in human endothelial cells[J].Hung‐Chih Lin;;Shih‐Li Su;;Chia‐Yang Lu;;Ai‐Hsuan Lin;;Wan‐Chun Lin;;Chin‐San Liu;;Ya‐Chen Yang;;Hsiu‐Miao Wang;;Chong‐Kuei Lii;;Haw‐Wen Chen.Environmental Toxicology,2017(3)
[2]Andrographolide sulfonate ameliorates lipopolysaccharide-induced acute lung injury in mice by down-regulating MAPK and NF-κB pathways[J].Shuang Peng;;Nan Hang;;Wen Liu;;Wenjie Guo;;Chunhong Jiang;;Xiaoling Yang;;Qiang Xu;;Yang Sun.Acta Pharmaceutica Sinica B,2016
[3]Effects of andrographolide on the activation of mitogen activated protein kinases and nuclear factor-κB in mouse peritoneal macrophage-derived foam cells[J].Fu-xing Li;Shu-sheng Li.Chinese Journal of Integrative Medicine,2012(5)
[4]Cultured Human Airway Epithelial Cells(Calu-3):A Model of Human Respiratory Function,Structure,and Inflammatory Responses[J].Yan Zhu;;Aaron Chidekel;;Thomas H.Shaffer;;Hector R.Wong.Critical Care Research and Practice,2010
[5]何雯.四种穿心莲内酯水溶性衍生物在Caco-2和Calu-3单细胞层模型上的转运研究[D].扬州大学,2018.