背景[1-3]
RH-35大鼠肝癌细胞是一种常用的实验细胞系，来源于大鼠的肝癌组织。这种细胞系在科学研究中有广泛的应用，尤其是在肝癌发病机制和药物筛选方面。
RH-35大鼠肝癌细胞的形态特征包括贴壁生长、上皮细胞样外观和大小不均一等。这些细胞通常呈现多角形或不规则形状，有时会有突起。在培养条件下，RH-35大鼠肝癌细胞需要使用适合的培养基，如DMEM、F-12等，并添加适量的生长因子和血清来维持其生长状态。
为了保持RH-35大鼠肝癌细胞的正常生长和特性，需要注意以下几点：
培养基和添加剂的质量：应选择高质量的培养基和添加剂，避免使用过期或劣质的试剂。
温度和气体控制：RH-35大鼠肝癌细胞需要在适宜的温度和气体条件下培养，通常为37℃和95%空气（细胞代谢必需的）。
传代和冻存：当细胞生长到一定密度时，需要进行传代或冻存以维持细胞系的状态。传代时应使用适量的胰蛋白酶或胶原酶进行消化，并控制好浓度和作用时间。冻存时应选择适当的保护剂，如二甲基亚砜（DMSO）等，并控制好冷冻速率和复温速率。
微生物污染：应定期检查培养的细胞是否受到微生物污染，如有疑虑应及时处理。
细胞鉴别：在使用RH-35大鼠肝癌细胞时，应进行细胞鉴别，以确保细胞的特性和纯度。
RH-35大鼠肝癌细胞
RH-35大鼠肝癌细胞培养操作
1)复苏RH-35大鼠肝癌细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。
将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2)RH-35大鼠肝癌细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。
d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。
3)RH-35大鼠肝癌细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；
a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。
b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。
c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
应用[4-5]
RH-35大鼠肝癌细胞可以用于SPINK1调节大鼠正常肝细胞BRL-3A和大鼠肝癌细胞RH-35增殖的分子机理及其比较分析
通过免疫共沉淀(immunoprecipitation assay,IP)的方法也发现SPINK1能够与EGFR相结合。最近的研究表明EGFR被生长因子等激活后,能够通过p38MAPK、ERK、JNK、PKC、JAK-STAT和AKT等多条信号通路促进细胞的增殖。本文通过IPA(Ingenuity Pathway Analysis 9.0)软件,结合相关文献分析SPINK1与EGFR信号通路的互作网络,发现SPINK1可能与EGFR结合后通过上述6条信号通路调控细胞的增殖。
为探究SPINK1调控肝细胞和肝癌细胞增殖的机理,本文通过基因添加的方法处理BRL-3A细胞,并用重组蛋白处理BRL-3A细胞和RH-35大鼠肝癌细胞,通过MTT、EdU、流式细胞术等方法检测SPINK1上调表达对上述两种细胞活力、增殖和周期等的影响,通过免疫共沉淀、qRT-PCR和western blot等方法推测SPINK1调控两种细胞增殖的机理。
结果表明,通过基因添加的方法上调BRL-3A细胞内源性Spink1的表达后,细胞的生长活力和增殖,S期和G2/M期的细胞数量,细胞增殖和抗凋亡相关基因/蛋白的表达都明显增加,然而,G1期的细胞数量和促凋亡相关基因/蛋白的表达都明显减少。通过qRT-PCR和western blot等方法检测SPINK1信号通路相关基因/蛋白的变化,发现p38,ERK和JNK信号通路相关基因/蛋白的表达发生显著的变化。当用外源性的重组大鼠SPINK1蛋白(rat recombinant SPINK1,rrSPINK1)处理BRL-3A细胞时,所得到的结果与上述结果相似。
当用rrSPINK1处理RH-35大鼠肝癌细胞时,我们发现与处理BRL-3A细胞所得到的结果相似,RH-35大鼠肝癌细胞的生长活力和增殖,S期和G2/M期的细胞数量,细胞增殖和抗凋亡相关基因/蛋白的表达都明显提高,G1期的细胞数量和凋亡相关基因/蛋白的表达都明显减少。qRT-PCR和western blot检测结果表明,在RH-35大鼠肝癌细胞中,p38和JAK-STAT3信号通路相关基因/蛋白的表达发生显著的变化。本文用pEGFR抗体处理稳定表达内源性Spink1的阳性单克隆BRL-3A细胞发现,该细胞的生长活力受到明显的抑制,并且抑制效果随着抗体剂量的增加愈加明显,进一步验证了SPINK1与EGFR结合后发挥其相应的功能。
综上所述,SPINK1与EGFR结合后通过p38、ERK和JNK等3条信号通路调控细胞增殖相关基因/蛋白MYC和CCND1和凋亡相关基因/蛋白BAX,CASPASE3的表达,促进BRL-3A细胞的增殖;通过p38和JAK-STAT3等2条信号通路调控细胞增殖相关基因/蛋白MYC和CCND1和凋亡相关基因/蛋白CASPASE3的表达,进而促进RH-35大鼠肝癌细胞的增殖。
参考文献
[1]Liver transplantation for hepatocellular carcinoma beyond the Milan criteria:A review[J].Dong-Wei Xu;Ping Wan;Qiang Xia.World Journal of Gastroenterology,2016(12)
[2]Effect of SecinH3 on lung injury induced by sepsis of rats[J].Feng Guo;Chun-Yan Yan.Asian Pacific Journal of Tropical Medicine,2015(12)
[3]Mechanisms of resistance to EGFR tyrosine kinase inhibitors[J].Lihua Huang;Liwu Fu.Acta Pharmaceutica Sinica B,2015(05)
[4]Ursolic acid inhibits proliferation and induces apoptosis of HT-29 colon cancer cells by inhibiting the EGFR/MAPK pathway[J].Jian-zhen SHAN1,Yan-yan XUAN2,Shu ZHENG2,Qi DONG2,Su-zhan ZHANG2(1Department of Traditional Chinese Medicine,the Second Affiliated Hospital,School of Medicine,Zhejiang University,Hangzhou 310009,China)(2Cancer Institute,School of Medicine,Zhejiang University,Hangzhou 310009,China).Journal of Zhejiang University(Science B:An International Biomedicine，Biochemistry&Biotechnology Journal),2009(09)
[5]赵卫明.SPINK1调节大鼠正常肝细胞BRL-3A和大鼠肝癌细胞RH-35增殖的分子机理及其比较分析[D].河南师范大学,2018.