背景[1-3]
ATGL抗体也被称为脂肪甘油三酯脂酶抗体（Adipose Triglyceride Lipase Antibody），是专门针对脂肪甘油三酯脂酶（ATGL）的特异性抗体。这种酶在哺乳动物的脂肪组织中起着关键作用，特别是在催化甘油三酯水解的初始步骤中。
ATGL抗体的来源可以是兔等动物，具有多克隆性，并且可以与人类、大鼠、小鼠等物种的ATGL发生交叉反应。在科研实验中，ATGL抗体常被用于检测ATGL在细胞或组织中的表达水平，以及研究其在肥胖、糖尿病等代谢性疾病中的病理生理学作用。
此外，ATGL抗体还可以应用于多种实验技术中，如Western Blotting（蛋白质印迹）、ELISA（酶联免疫吸附测定）、免疫细胞化学（ICC/IF）等，以研究ATGL的分子机制、信号传导途径以及与其他蛋白质的相互作用。
ATGL抗体
ATGL（脂肪甘油三酯脂酶）抗体的制备过程通常包括以下步骤：
1.抗原准备：首先需要准备ATGL抗原。这通常涉及到从合适的来源（如哺乳动物组织或细胞系）中分离和纯化ATGL蛋白。在这个过程中，保持抗原的天然构象和活性至关重要。
2.免疫动物的选择：选择合适的免疫动物进行免疫。常见的免疫动物包括小鼠、大鼠、兔子等。在选择免疫动物时，需要考虑到动物的体积、生理特征以及抗原的种类等因素。
3.免疫程序：将制备好的ATGL抗原与免疫动物进行免疫。免疫的途径可以是皮下注射、腹腔注射等。在免疫过程中，可能需要根据实验要求进行多次免疫，以提高抗体的效价。
4.血清收集：在完成免疫程序后，需要定期采集免疫动物的血清样本。血清中含有免疫动物产生的抗体，这些抗体可以用于后续的实验。
5.抗体纯化：从采集到的血清样本中，通过特定的纯化方法（如蛋白A/G亲和层析柱或其他纯化技术）来纯化ATGL抗体。这个过程可以去除血清中的杂质，提6.高抗体的纯度和特异性。
7.抗体鉴定：对纯化后的ATGL抗体进行鉴定，以确认其能够特异性地识别和结合ATGL蛋白。鉴定方法包括Western Blotting、ELISA等。
8.抗体分装与保存：将鉴定合格的ATGL抗体进行分装，并在适当的条件下保存（如-20℃或-80℃）。
应用[4][5]
ATGL抗体可以用于炎症条件下色素上皮衍生因子（PEDF）对血管通透性的影响及其机制研究
明确炎症条件下血清PEDF的表达变化,并进一步探讨PEDF对血管通透性的影响及其相关机制。
材料和方法1.以脓毒症模拟典型炎症条件,采集严重烧伤脓毒症患者和三种不同脓毒症小鼠(分别为严重烧伤脓毒症、盲肠结扎穿刺(cecal ligation and puncture,CLP)脓毒症和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的脓毒症)的血清,同时采用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)和ATGL抗体蛋白印迹实验(Western blotting,WB)的方法检测血清中PEDF的表达变化。
2. 制作CLP脓毒症小鼠模型,尾静脉注射外源性PEDF和PEDF单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb),观察小鼠气管血管和提睾肌血管荧光微球漏出以及小鼠皮肤微血管伊文思蓝(evan’sblue,eb)漏出情况,同时检测小鼠血液中异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate,fitc)标记的右旋糖酐的荧光强度。
3. 培养人皮肤微血管内皮细胞(humandermalmicrovascularendothelialcells,hdmecs),检测细胞在不同浓度pedf作用不同时间的条件下,跨细胞电阻(transendothelialelectricalresistance,ter)的变化。
4. 培养hdmecs,随机分为正常对照组、pedf处理组、lps处理组、肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-α,tnf-α)处理组、pedf+lps联合处理组和pedf+tnf-α联合处理组,检测transwell中fitc标记的右旋糖酐漏出情况和rhoa激活情况,同时ATGL抗体细胞免疫荧光染色观察应力纤维f-actin和紧密连接闭锁小带(zonulaoccludens-1,zo-1)的形态变化。
5. 外源性加入rhoa特异性抑制剂c3转移酶,检测细胞transwell荧光漏出情况和rhoa激活情况,同时ATGL抗体细胞免疫荧光染色观察应力纤维f-actin和紧密连接蛋白zo-1的形态变化。
6. 提取细胞膜蛋白和组织总蛋白,检测pedf的受体脂肪甘油三酯酯酶(adiposetriglyceridelipase,atgl)和层粘连蛋白受体(lamininreceptor,lr)在炎症条件下的表达变化,并采用ATGL抗体免疫共沉淀(immunoprecipitation,ip)的方法检测pedf与其受体间的相互作用。
7. 构建pedf受体的慢病毒干扰载体,分别干扰atgl和lr,检测transwell荧光漏出情况和rhoa激活情况,同时细胞免疫荧光染色观察紧密连接蛋白zo-1的形态变化。
ATGL抗体结果1.以脓毒症模拟典型炎症条件,我们发现在严重烧伤脓毒症患者中,血清pedf的表达是显著增高的。在三种脓毒症小鼠中,血清pedf的表达整体呈增高趋势。具体而言,严重烧伤脓毒症小鼠血清pedf水平从伤后6h开始增高,至12h达到峰值,随后开始下降;clp脓毒症小鼠血清pedf水平从伤后3h开始增高,至12h达到峰值,随后开始下降;而lps脓毒症小鼠血清pedf水平在伤后3h达到峰值,随后出现波动变化。
2. 在正常小鼠中,大剂量pedf单独作用能够引起血管通透性的增高,表现为荧光微球和eb漏出增多,血液荧光强度降低。在脓毒症小鼠中,血管通透性明显高于正常小鼠,注入外源性pedf能够使得已经增高的血管通透性进一步增高,而注入pedf-mab则能抑制炎症条件下血管通透性的增高。
3. pedf对血管内皮细胞通透性的影响呈现剂量和时间的依赖关系。
4. 在LPS和TNF-α炎症介质处理条件下,内皮细胞旁通透性增高,而外源性PEDF能够使得已经增高的细胞旁通透性进一步增高,表现为Transwell中FITC标记的右旋糖酐大量漏出。PEDF增高内皮细胞旁通透性主要是通过引起应力纤维F-actin的重排和紧密连接蛋白ZO-1的分解。
5.大剂量PEDF单独作用能够引起RhoA的激活、应力纤维F-actin的重排和紧密连接蛋白ZO-1的分解。在炎症条件下,PEDF的这种效应更加明显,而RhoA的特异性抑制剂C3转移酶能够抑制PEDF增高血管通透性这一效应。
6.在炎症条件下,细胞膜表面和小鼠内脏组织ATGL抗体检测结果ATGL受体表达增加,并且与PEDF的相互作用增强,而LR受体无明显变化。
7.在ATGL稳定缺失的内皮细胞中,外源性PEDF不能够引起RhoA的激活、细胞旁通透性的增高和紧密连接蛋白ZO-1的分解。而在LR稳定缺失的内皮细胞中,外源性PEDF仍然能够引起RhoA的激活、细胞旁通透性的增高和紧密连接蛋白ZO-1的分解。
参考文献
[1]Why have clinical trials in sepsis failed?[J].John C.Marshall.Trends in Molecular Medicine,2014
[2]Identification of Differentially Expressed Serum Proteins in Infectious Purpura Fulminans[J].Ting He;;Jiong-yu Hu;;Jian Han;;Dong-xia Zhang;;Xu-pin Jiang;;Bing Chen;;Yue-sheng Huang;;Seul-Ki Jeong.Disease Markers,2014
[3]Clinical correlates of serum pigment epithelium-derived factor in type 2 diabetes patients[J].Alicia J.Jenkins;;Dongxu Fu;;Madona Azar;;Julie A.Stoner;;Derrick G.Kaufman;;Sarah Zhang;;Richard L.Klein;;Maria F.Lopes-Virella;;Jian-xing Ma;;Timothy J.Lyons.Journal of Diabetes and Its Complications,2014
[4]Severe sepsis and septic shock[J].Christa A Schorr;;Sergio Zanotti;;R Phillip Dellinger.Virulence,2014(1)
[5]何婷.炎症条件下色素上皮衍生因子（PEDF）对血管通透性的影响及其机制研究[D].第三军医大学,2016.