白头翁皂苷A3的制备方法

2020/2/20 8:45:53

背景及概述[1]

白头翁为毛茛科植物白头翁(拉丁学名:Pulsatillachinensis(Bunge)Regel)的干燥根,其具有清热解毒,凉血止痢的作用,白头翁提取物中已经分离出多种有效成分,如白头翁总皂苷、原白头翁素、白头翁素、白头翁灵等物质,根据现有技术报道,白头翁提取物对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、痢疾杆菌、枯草杆菌、伤寒杆菌、沙门氏杆菌以及一些皮肤真菌等具有抑制作用,但白头翁提取物中,主要起抑菌作用的为原白头翁素,白头翁总皂苷的抑菌效果较差。在白头翁总皂苷中具有多种五环三萜类皂苷,其中白头翁皂苷A3(CAS:129724-84-1)作为白头翁中提取出的皂苷类化学成分的中的一种,在现有技术中被认为能够具有一定抗癌活性。

结构[2-3]

白头翁皂苷A3的血管舒张作用。白头翁皂苷A3是从毛莨科白头翁的根部分离提取得到的羽扇豆烷型三萜皂苷类化合物。有实验通过对白头翁皂苷A3舒张SD大鼠离体阻力血管的作用进行观察研究,首次发现白头翁皂苷A3具有舒血管作用,并对其作用机制进行初步探讨。记录大鼠肾动脉血管环等张力的变化,观察白头翁皂苷A3对预收缩血管的作用。结果显示白头翁皂苷A3使预收缩的SD大鼠胸主动脉、大脑中动脉、肾动脉和左冠状动脉产生浓度依赖性的舒张作用。对U46619、内皮素-1、去氧肾上腺素或氯化钾预收缩的肾动脉白头翁皂苷A3能产生浓度依赖性的舒张作用。去内皮或者用北非蝎毒素加蜂毒明肽(charybdotoxin+apamin)预处理能轻微拮抗白头翁皂苷A3产生的舒血管作用。四乙铵能抑制白头翁皂苷A3对有内皮和去内皮肾动脉的舒张作用,而格列本脲、氯化钡和辣椒素对白头翁皂苷A3的舒血管作用无影响。白头翁皂苷A3对60mM氯化钾预收缩肾动脉的舒张作用弱于受体依赖型的配体收缩剂。白头翁皂苷A3能通过部分阻断硝苯地平敏感性的电压门控钙离子通路、非硝苯地平敏感性的受体操纵钙离子通路以及内钙释放来降低[Ca2+]i。用硝苯地平预处理血管能部分拮抗白头翁皂苷A3对去氧肾上腺素预收缩肾动脉的舒张作用。结论:白头翁皂苷A3对预收缩的大鼠肾动脉产生浓度依赖性舒张作用,该作用涉及多种作用机制,其中包括:CTX/apamin敏感性内皮源性超极化因子、四乙铵敏感性K+通道、外钙内流和内钙释放。

另外,有研究制备含有白头翁皂苷妇科用复方组合物,由作为活性成分的硝酸咪康唑与白头翁皂苷A3,和至少一种用于阴道给药制剂的辅料组成;所述组合物中硝酸咪康唑与白头翁皂苷A3的质量比为1:0.6~1.0。所述组合物制备成为凝胶剂,所述辅料选自卡波姆、保湿剂、防腐剂、表面活性剂、pH调节剂中的一种或几种,以及余量的水。

制备[3]

利用微生物酶法转化白头翁总皂苷,结合硅胶柱层析法和结晶法对酶产物进行分离,制备高活性的稀有白头翁皂苷A3。将1000g中药白头翁经乙醇浸提3次,再经脱糖、脱色处理后共得总皂苷98.6g,得率为9.86%。采用微生物Absidiasp.P00r发酵产粗酶液,对50g总皂苷进行酶反应,酶解产物经脱糖、脱色处理后,得到含白头翁皂苷A3的粗产物34.2g。通过硅胶柱层析和结晶法对产物进行分离纯化,制备得到白头翁皂苷A3单体1.56g,得率为4.56%,HPLC检测其纯度为95.4%。具体步骤如下:

1)白头翁皂苷的生物转化:白头翁总皂苷用20mol/LpH5.0的HAc-NAAc缓冲液配成质量分数为2%的酶反应底物,加入等体积酶液,40℃条件下于5L反应釜中反应24h。反应液经AB-8脱糖、D-296脱色处理后浓缩蒸干,即得白头翁皂苷酶解产物。

2)硅胶层析分离白头翁皂苷酶解产物:取制得的白头翁皂苷酶解产物,以3倍样品质量的80~100目硅胶制成样品胶,15倍样品质量的300~400目硅胶做分离胶。用一定量的纯氯仿通柱,按照V(氯仿)∶V(甲醇)=9.5∶0.5、9∶1、8.8∶1.2、8.5∶1.5依次进行洗脱。每200mL收集一瓶,并用TLC法跟踪检测。

3)结晶法纯化白头翁皂苷A3:将硅胶柱分离得到的含白头翁皂苷A3的组分溶于甲醇中,室温放置,自然挥发结晶,得到针状晶体。过滤收集针状物,再将针状晶体用甲醇加热溶解、过滤,不溶物单独收集,滤液放置室温下挥发重结晶,24h后有针状晶体析出,积累到一定程度时,过滤收集晶体。

主要参考资料

[1] CN201811628876.5含有白头翁皂苷妇科用复方组合物

[2] 白头翁皂苷A3的血管舒张作用及机制研究

[3] 生物转化法制备白头翁皂苷A3

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