背景[1-3]
CD9抗体是一个非偶联、分子量约25 kDa、兔源、抗CD9多克隆抗体。它可用于人、小鼠、大鼠背景下WB、IHC-P、ICC/IF、IP、FC实验，且不带标记。
CD9，即白细胞分化抗原9，别名MIC3、TSPAN29、GIG2、MRP1等。它是一种多次跨膜的糖蛋白，属于四跨膜蛋白家族（Tetraspanin），在多种细胞表面表达，包括白细胞、血小板、内皮细胞等。CD9的作用机制涉及与多种蛋白质相互作用，形成四跨膜蛋白富集的微区（TEMs），调控细胞黏附、细胞运动、细胞信号传导等过程。CD9在细胞间的相互作用、免疫应答、肿瘤转移、精卵融合等过程中发挥重要作用。例如，在肿瘤细胞中，CD9的表达可能与肿瘤的侵袭性和转移能力相关，而在免疫细胞中，它参与调节免疫突触的形成和细胞外囊泡的功能。此外，CD9还可能作为某些疾病的治疗靶点或生物标志物，具有重要的临床应用潜力。
CD9抗体
CD9抗体使用步骤（Western Blot）：
1.样本制备
1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-细胞/组织裂解液缓冲液），混匀。
2）贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。
3）充分裂解后，10000-14000g离心3-5min，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。
2.蛋白电泳
1）取出预制胶，将预制胶固定在电泳槽中，内槽加满tris-glycine电泳缓冲液。
2）在室温或不超过37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上样缓冲液。水浴溶解后立即室温存放。
3）混合蛋白样品和5XSDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
4）100℃或沸水浴加热3-5min，以充分变性蛋白，之后冷却至室温备用。
5）上样蛋白，并在1个孔中上样蛋白marker，盖上电泳槽盖，打开电源，电泳至蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。
6）电泳后取出胶板，用刀在侧边硅胶处，沿着两片玻璃缝隙切开硅胶，即可打开玻璃板；取胶时。
3.转膜与封闭
1）将胶浸于预冷的转膜缓冲液中平衡5min。
2）依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入预冷的转膜缓冲液中平衡10min，如用PVDF膜，需参照说明书，先用纯甲醇浸泡1-2min，再孵育于预冷的转膜缓冲液中。
3）装配转移三明治：海绵/3层滤纸/胶/膜/3层滤纸/海绵，每层放好后，用试管赶尽气泡。
4）将转移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近阳极，胶靠近阴极，加入转移缓冲液，插上电极，100V，1h（电流约为0.3A）。
5）转膜结束后，切断电源，取出膜。
6）将膜浸没在5mL丽春红染色液中，置于轨道摇床上室温染色5~10min或更长，直待膜上显示出蛋白条带。
7）清洗：取出膜，用蒸馏水，PBS或者其他适当溶液冲洗至背景清晰后拍照，大概冲洗2~3次，每次5min。
8）脱色：将膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脱液，再重复一次。
9）清洗：再用蒸馏水清洗膜2~3次，每次5min。
10）将膜置于25mL封闭缓冲液中，在室温下孵育1小时。
11）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。
4.抗体孵育与检测
1）将膜和一抗（CD9抗体按照产品应用推荐稀释度）置于10mL一抗稀释缓冲液中在4℃下孵育过夜并不时轻轻晃动。
2）用5mL TBST洗涤三次，每次15min以去除残留的一抗(CD9抗体)。
3）将膜和二抗（按照产品应用推荐稀释度）置于10mL封闭缓冲液中孵育1-2小时并不时轻轻晃动。
4）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。
5）最后一次洗膜的同时，按照ECL超敏试剂盒说明书，新鲜配制发光工作液。
6）用平头镊取出膜，搭在滤纸上沥干洗液。将膜完全浸入发光工作液中，与发光工作液充分接触。室温孵育3min，准备立即压片曝光。但勿洗去发光液。
7）显影曝光。
应用[4][5]
CD9抗体可以用于MSCs源性外泌体对创伤性脑损伤后外周免疫反应的作用研究
实验通过动物实验和细胞分子实验分析MSCs源性外泌体对TBI后大鼠外周免疫细胞活化情况、炎症因子表达水平、损伤脑组织炎症反应以及神经细胞凋亡情况的影响,进而评估MSCs源性外泌体对TBI后大鼠外周免疫反应的干预效果,为探索TBI后外周免疫异常治疗的新策略提供理论参考。
方法:1.取成年SD大鼠骨髓来源的充质干细胞(MSCs),使用专用培养基培养,收取MSCs培养基上清液,利用超高速离心法从中分离出外泌体,并利用电镜、纳米颗粒跟踪分析(NTA)以及CD9抗体蛋白质印记实验(WB)进行外泌体鉴定。2.将成年SD大鼠(8周龄,180-220g)随机分成4组,分别为假损伤组(Sham)、创伤性脑损伤组(TBI)、假损伤+外泌体组(Sham+exo)和创伤性脑损伤+外泌体组(TBI+exo)。随后我们利用控制性皮层损伤方法来构造SD大鼠脑创伤模型,在TBI组及TBI+exo组模型构造后的6个小时内将MSCs源性外泌体通过尾静脉途径注射入大鼠体内。在术后第1、3、7、28天分别收集大鼠外周血,梯度离心法分离出外周血单个核细胞(PBMCs)以及血清,流式细胞术(FCM)检测T细胞亚群、B细胞百分比,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和血清中免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)的表达水平。对比各组间的差异,分析TBI对大鼠外周免疫反应的诱发作用以及MSCs源性外泌体对TBI后外周免疫反应干预作用。3.在TBI后第1、3、7、14、28天利用改良神经功能缺损评分(mNSS)表评估各组大鼠运动感觉功能。在TBI后第1、3、7、28天分别处死各组部分大鼠,分离脑组织,利用尼氏染色和TUNEL染色观察神经元凋亡情况。将大脑皮层组织制备成匀浆,先利用ELISA实验检测脑皮质中促炎因子白介素1β(IL-1β)、白介素6(IL-6)、TNF-α、IFN-γ和抑炎因子白介素4(IL-4)、白介素10(IL-10)、转化生长因子β(TGF-β)的表达水平。然后利用RT-PCR检测M1型小胶质细胞表面分子INOS和M2型小胶质细胞表面分子Arg-1的表达水平。对比各组间差异,分析MSCs源性外泌体干预TBI大鼠外周免疫反应后对神经功能恢复的作用。
CD9抗体结果:1.通过控制性皮层损伤方法对大鼠脑组织进行打击,并成功构建TBI大鼠模型。通过皮层打击后大鼠立即出现呼吸浅慢、毛发竖立等表现,待大鼠清醒后则会出现打击部位对侧肢体瘫痪,向对侧绕圈爬行,分离其脑组织发现右侧大脑皮层出现明显病灶。2.从MSCs中成功提取到外泌体。通过电镜、纳米颗粒跟踪分析、CD9抗体Western Blot验证了其为直径主要在100nm-200nm之间的呈典型的“杯盘”状的囊性小泡,CD9、CD81表达明显。
参考文献
[1]Human umbilical cord mesenchymal stem cell-derived exosome suppresses programmed cell death in traumatic brain injury via PINK1/Parkin-mediated mitophagy.[J].Zhang Li;Lin Yixing;Bai Wanshan;Sun Lean;Tian Mi.CNS neuroscience&therapeutics.2023
[2]Tumor Necrosis Factor-stimulated Gene-6(TSG-6)Secreted by BMSCs Regulates Activated Astrocytes by Inhibiting NF-κB Signaling Pathway to Ameliorate Blood Brain Barrier Damage After Intracerebral Hemorrhage[J].Bin Tang;Min Song;Xun Xie;Dongsheng Le;Qiulin Tu;Xiang Wu;Min Chen.Neurochemical Research.2021
[3]Microglia and macrophage metabolism in CNS injury and disease:The role of immunometabolism in neurodegeneration and neurotrauma[J].Nicholas A.Devanney;;Andrew N.Stewart;;John C.Gensel.Experimental Neurology.2020
[4]Repopulating Microglia Promote Brain Repair in an IL-6-Dependent Manner[J].Emily F.Willis;;Kelli P.A.MacDonald;;Quan H.Nguyen;;Adahir Labrador Garrido;;Ellen R.Gillespie;;Samuel B.R.Harley;;Perry F.Bartlett;;Wayne A.Schroder;;Abi G.Yates;;Daniel C.Anthony;;Stefan Rose-John;;Marc J.Ruitenberg;;Jana Vukovic.Cell.2020
[5]魏坤.MSCs源性外泌体对创伤性脑损伤后外周免疫反应的作用研究[D].西南医科大学,2024.