背景[1-3]
A3人T淋巴细胞白血病细胞来自Jurkat细胞系，是用Fas抗体处理Jurkat细胞，随后有限稀释法获得一个细胞系。A3细胞系对Fas介导的凋亡产生自发抗性的比例较低，得到的亚克隆对Fas-介导的凋亡十分敏感。挑选对新霉素具有抗性的野生型A3细胞，并三次用移码突变诱变剂ICR-191进行处理以分离具有抗Fas抗体杀伤的隐性突变体。
A3人T淋巴细胞白血病细胞
LEC1仓鼠卵巢细胞细胞的复苏与培养操作步骤:
1.水浴锅37℃预热，并将完全培养基温浴到37℃。
2.在15 mL离心管中加入5 mL以上完全培养基备用。
3.从液氮或-80℃冰箱中取出细胞，放入37℃水浴锅中，快速晃动，使冻存液迅速融化。
4.用75%医用酒精擦拭冻存管外表面。
5.在超净台中打开冻存管，用巴氏吸管或移液枪吸取细胞冻存悬液，转移至先前准备的15 mL离心管中。
6.用1 mL完全培养基洗涤冻存管1次，收集残留细胞至上述15 mL离心管，减少损失。
7.细胞悬液以250×g离心4 min。
8.离心后去除上清。加入1 mL完全培养基，轻柔吹打细胞沉淀，充分吹散、混匀。
9.将细胞平均接种到1个T25培养瓶或底面积相当的培养容器中。加入足量完全培养基，1个T25培养瓶中培养基总量不少于5 mL。
10.放入37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中。
11.复苏次日，观察细胞状态，并更换新鲜的完全培养基或传代。
12.之后，每2-3天更换一次完全培养基，直到细胞生长至80%汇合，即需传代。
LEC1仓鼠卵巢细胞的传代操作步骤:
1.将完全培养基、0.25%Trypsin-EDTA（以下简称胰酶）预热至37℃。
2.吸去培养容器中的培养基。
3.用PBS(1X)（货号：MA0015）（T25培养瓶加入约3 mL，T75培养瓶加入约6 mL）洗涤细胞2次，注意动作轻柔，清洗全面。吸去PBS。
4.加入胰酶（T25培养瓶加入约0.5~1 mL，T75培养瓶加入约1~1.5 mL），迅速铺匀，保证充分接触细胞表面。
5.显微镜下观察消化情况，约70%~80%细胞收缩变圆后，轻拍培养容器外壁，使细胞脱离培养表面。
6.立即加入完全培养基（T25培养瓶加入约1.5~3 mL，T75培养瓶加入约3~4.5 mL），随即轻摇培养容器，使培养基和胰酶迅速混匀，终止消化。
7.使用吸管或移液管吸取细胞悬液，吹打培养容器底面数次，尽可能将细胞都吹打下来。
8.将细胞悬液转移至离心管中。用PBS（T25培养瓶加入约3 mL，T75培养瓶加入约4 mL）洗涤容器1次，收集残留细胞。
9.收集的所有细胞悬液以250×g离心4 min。
10.离心后去除上清。加入1 mL完全培养基，轻柔吹打细胞沉淀，充分吹散、混匀。
11.将细胞按推荐传代比例（传第一代时可适当减少比例，如1:2~1:3）接种至适宜的培养容器内。
12.摇匀细胞，放入37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中。
13.传代次日，观察细胞状态。培养期间可参考推荐换液频率进行换液。
14.待细胞生长至90%汇合，即需传代或冻存。
LEC1仓鼠卵巢细胞冻存操作步骤:
1.待细胞生长至可传代的密度，即可准备冻存。
2.细胞消化请参考细胞的传代操作步骤1~9。
3.离心后去除上清，用适量冻存液均匀重悬细胞。
4.将细胞按比例或数量分装至冻存管中。
5.若选用通用细胞冻存液，请在操作前将梯度降温盒放入4℃冰箱内预冷，细胞分装完后将冻存管放入梯度降温盒再放入-80℃冰箱中。
6.若选用无血清非程序细胞冻存液，请将冻存管直接分散放入-80℃冰箱中。
7.8 h后即可将细胞转移入液氮长期保存。
应用[4][5]
A3人T淋巴细胞白血病细胞可以用于影响颅脑创伤患者凝血功能疗法的基础与临床研究
究采用候选策略,利用成人中重型颅脑创伤(moderate to severe traumatic brain injury)患者的外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMC),通过流式细胞术、Real-time q PCR技术验证七个lnc RNA(lnc RNA4916、lnc RNA7406-2、lnc RNA1403、lnc RNA2448-11、lnc RNA7411-2、lnc RNA4551-1、lnc RNA5189-2)是否参与HS治疗TBI前后单核细胞表型的变化及相关细胞因子表达的变化,筛选出与HS的免疫调节功能相关的lnc RNA。方
法:中重型颅脑创伤患者34例进行前瞻性研究。入选患者采用随机数字表法随机分为两组:7.5%HS治疗组(A组)、3%HS治疗组(B组)。两组患者采取一致的纳入和排除标准,进入相应的研究组后给予除不同浓度的HS之外相同的治疗方案,采用组间相互对照及组内治疗前后自身对照,观察其颅内压下降的情况、凝血纤溶指标的改变以及预后情况。在患者治疗前、治疗后6h及24h后从静脉分别采集血液样本,淋巴细胞分离液分离患者外周血单个核细胞,流式细胞术检测单核细胞表型偏移。体外培养人单核细胞系(THP-1)、人B淋巴细胞系(Raji)及A3人T淋巴细胞白血病细胞,检测lnc RNAs(lnc RNA4916、lnc RNA1403、lnc RNA2448-11、lnc RNA7411-2、lnc RNA4551-1、lnc RNA5189-2)的表达谱,筛选出只在单核细胞表达或单核细胞优势表达的候选lnc RNAs。RT-q PCR检测患者外周血单个核细胞候选lnc RNAs及受其调控的编码基因(TNF-α、IL-6、IL-1β、TGF-β、TM)的表达。
结果:7.5%HS治疗可有效降低中重型颅脑创伤患者的颅内压,同时并不会破坏患者凝血功能的平衡。对经7.5%HS与3%HS治疗的中重型颅脑创伤患者外周血单核细胞的流式细胞分析显示,7.5%HS可明显抑制中重型颅脑创伤患者CD14++CD16+促炎亚型单核细胞的增加。RT-q PCR检测结果显示7.5%高渗盐水可抑制中重型颅脑创伤患者外周血单核细胞lnc RNA2448-11和lnc RNA1403的表达并影响其靶基因的转录。
参考文献
[1]Therapeutic hypothermia and targeted temperature management in traumatic brain injury:Clinical challenges for successful translation[J].W.Dalton Dietrich;;Helen M.Bramlett.Brain Research.2016
[2]Long noncoding RNA-MEG3 is involved in diabetes mellitus-related microvascular dysfunction[J].Gui-Zhen Qiu;;Wei Tian;;Hai-Tao Fu;;Chao-Peng Li;;Ban Liu.Biochemical and Biophysical Research Communicatio,2016
[3]Traumatic brain injury advancements[J].Bellal Joseph;;Ansab Haider;;Peter Rhee.Current Opinion in Critical Care,2015(6)
[4]Long noncoding RNA:Novel links between gene expression and innate immunity[J].Susan Carpenter.Virus Research.2016
[5]杨细平.影响颅脑创伤患者凝血功能疗法的基础与临床研究[D].天津医科大学,2016.