背景[1-3]
犬瘟热病毒(CDV)ELISA试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）检测样本中的犬瘟热病毒(CDV)。
检测原理：往预先包被犬瘟热病毒（CDV）捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成终的。颜色的深浅和样品中的犬瘟热病毒（CDV）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。
犬瘟热病毒(CDV)ELISA试剂盒
犬瘟热病毒(CDV)ELISA试剂盒实验所需自备试验器材：
1.酶标仪（450nm）
2.高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
3.37℃恒温箱4.蒸馏水或去离子水
犬瘟热病毒(CDV)ELISA试剂盒样本处理及要求：
1.血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜，然后1000×g离心20分钟，取上清即可，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。2.血浆：用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内于2-8℃1000×g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。3.组织匀浆：用预冷的PBS(0.01M,pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。4.细胞培养物上清：请1000×g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。5.其它生物标本：1000×g离心20分钟，取上清即可检测。6.样品外观：样品应清澈透明，悬浮物应离心去除。7.样品保存：样品收集后若在1周内进行检测的可保存于4℃，若不能及时检测，请按一次使用量分装，冻存于-20℃（1个月内检测），或-80℃（6个月内检测），避免反复冻融，标本溶血会影响后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。
犬瘟热病毒(CDV)ELISA试剂盒操作步骤：
1.取出所需板条。
2.设置标准品孔和样本孔；
3.样本孔先加待测样本；空白孔不加。
4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。
5.弃去液体，加洗涤液，静置1min，甩去洗涤液,如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。
6.每孔加入底物A、B各，37℃避光孵育15min。
7.每孔加入终止液，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。
犬瘟热病毒(CDV)ELISA试剂盒结果判断绘制标准曲线：在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。
犬瘟热病毒(CDV)ELISA试剂盒试剂盒性能
1.准确性：标准品线性回归与预期浓度相关系数R值，大于等于0.9900。
2.灵敏度：最低检测浓度小于（参考说明书）
3.特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。
4.重复性：板内、板间变异系数均小于15%。
5.贮藏：2-8℃，避光防潮保存。
6.有效期：6个月。
应用[4][5]
犬瘟热病毒(CDV)ELISA试剂盒可以用于犬瘟热病毒F蛋白原核表达及其单克隆抗体制备
研究通过对CDV野毒LN(10)1株F基因序列进行分析,采用PCR方法克隆F蛋白胞外区基因,并与原核表达载体p ET-28a连接构建了p ET-28a-CDV-F重组质粒。经测序鉴定后将其转化至Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞,并使用优化后的条件对重组菌进行IPTG诱导,超声破碎后,经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹(Western blot)对其表达形式及其特异性进行鉴定。
实验结果显示,重组F蛋白在37℃、IPTG浓度为0.2 mmol/L,诱导6 h后表达量最高,主要以包涵体表达,蛋白大小约为33 k Da。利用KCl染色切胶纯化法成功纯化F重组蛋白,蛋白浓度为1.66 mg/m L。经Western blot鉴定后,重组F蛋白可以分别与抗His标签单克隆抗体和CDV阳性血清反应,具有良好的反应原性。为获得抗CDV F蛋白的单克隆抗体,将纯化后的重组F蛋白与弗氏佐剂等量乳化,以此为免疫原对BALB/c小鼠腹腔注射免疫。经3次常规免疫和1次加强免疫后取小鼠脾细胞与SP2/0细胞进行细胞融合,利用有限稀释法与犬瘟热病毒(CDV)ELISA试剂盒筛选阳性杂交瘤细胞,并将筛选出稳定分泌抗体的细胞株注射至小鼠腹腔制备腹水。最终获得2株单克隆抗体,命名为1B6和1G8。采用抗体亚类试剂盒对筛选出的2株单克隆抗体进行亚类鉴定,结果表明2株单克隆抗体均属于Ig M,κ型。以原核表达出的CDV F重组蛋白为包被抗原建立的间接ELISA法测得1B6、1G8上清效价分别为1:1 600和1:3 200,腹水效价均达到10～6。
参考文献
[1]First complete genome sequence of Asia-4 lineage of canine distemper virus in China.[J].Bi Zhenwei.Virus genes,2022(1)
[2]C Protein is Essential for Canine Distemper Virus Virulence and Pathogenicity in Ferrets.[J].Siering Oliver;Sawatsky Bevan;Pfaller Christian K.Journal of virology.2020
[3]Development of a double monoclonal antibody-based sandwich enzyme-linked immunosorbent assay for detecting canine distemper virus.[J].Zhang Yuan;Xu Gang;Zhang Lu;Zhao Jiakai;Ji Pinpin;Li Yaning;Liu Baoyuan;Zhang Jingfei;Zhao Qin;Sun Yani;Zhou EnMin.Applied microbiology and biotechnology.2020
[4]Viral Pathogenesis,Recombinant Vaccines,and Oncolytic Virotherapy:Applications of the Canine Distemper Virus Reverse Genetics System[J].Jianjun Zhao;;Yanrong Ren;;Jie Chen;;Jiasan Zheng;;Dongbo Sun.Viruses.2020
[5]隋萍.犬瘟热病毒F蛋白原核表达及其单克隆抗体制备[D].黑龙江八一农垦大学,2023.