1,1-环己基二乙酸单酰胺(CAM)是治疗中枢神经药加巴喷丁的中间体。在1,1-环己基二乙酸单酰胺合成过程中可能产生一些副产物以及残留未反应的原料、中间体,而这些化学成分的存在可能对加巴喷丁的合成产生影响。为了保证1,1-环己基二乙酸单酰胺的质量,必须对这些副产物、中间体、原料、降解产物加以控制。本文采用高效液相色谱法对1,1-环己基二乙酸单酰胺及相关物质的质量检测进行了研究。
分析方法[1]
1、HPLC仪器与色谱条件
美国Agilent 1100高效液相色谱仪VWD可变波长紫外检测器);色谱柱:Agilent SB-C18 100A;流动相:磷酸水溶液:乙腈=70:30(pH=1.9);流速:1.0mL/min;柱温:40℃;检测波长:210nm;进样量:20ul。
2、试剂与材料
乙腈为色谱纯,水为纯化水,其他试剂为分析纯,样品1,1-环己基二乙酸单酰胺由杭州泰华合成药有限公司生产。对照品:CDA(1,1-Cyclohexane diacetic acid)、CDI(Cyclohexane diacetimide)、1,1-环己基二乙酸单酰胺(Cyclohexane diacetic acid monoamide)由TEVA公司提供。
3、准确度
准确称取下列相近质量的1,1-环己基二乙酸单酰胺对照品6份到50mL的容量瓶中用流动相溶液溶解并加入相同体积、相同浓度的 1,1-环己基二乙酸单酰胺对照品溶液并用流动相溶液稀释至刻度进行回收率检测,得到以下数据,从数据表明准确度符合检测要求(见表1)。
4、精密度
准确称取1,1-环己基二乙酸单酰胺250mg到25mL的容量瓶中用流动相溶液稀释到刻度超声溶解，并在上述色谱条件下测定，平行测定6次，得到1,1-环己基二乙酸单酰胺(CAM)、CDA、CDI的面积归一法含量平均值和相对标准偏差RSD分别为99.73%、0.009%;0.06%、0.0%;0.21%、4.3%。
5、重现性
取不同的三批1,1-环己基二乙酸单酰胺样品用流动相溶液稀释到刻度超声溶解，在不同的实验室、不同人员的操作下并在上述相同的色谱条件进行检测得出三批1,1-环己基二乙酸单酰胺中CAM,CDI,CDA的面积百分含量平均值+偏差的数据分别为99.74%±0.01%、0.06%±0.01%、0.20%±0.00%;99.745%±0.005%、0.035%±0.005%、0.225%±0.005%;99.725%±0.005%、0.03%±0.00%、0.245%±0.005%。从此数据可以看出本检测方法具有良好的重现性。同时称取约250mg的1,1-环己基二乙酸单酰胺对照品6份用流动相溶液稀释到刻度超声溶解依次在上述相同的色谱条件下进样得到CAM、CDA、CDI的面积平均值和相对标准偏差 RSD分别为 13166.2、0.16%;8.2、0.12%;27.1、3.35%,根据2005年中国药典杂质分析指导原则并从以上数据分析得出此方法符合分析的要求。
6、专属性
称取约10mg/mL1,1-环己基二乙酸单酰胺对照品和供试品(20060905、20061001、20061002)溶液,在上述高效液相色谱方法条件下进行检测。称取约10mg/mL 1,1-环己基二乙酸单酰胺对照品4份分别用5%H2O2、0.1mol/HCl、0.1mol/NaOH、H2O溶解稀释到刻度在90℃的条件下处理24h后检测得到以下图谱:从图谱上可以看出在5%H2O2氧化条件下1,1-环己基二乙酸单酰胺基本全部氧化产生未知杂质;在0.1mol/HCl处埋的条件下1,1-环己基二乙酸单酰胺基本全部转化为CDA、CDI、和一个少量的未知杂质、期中按面积百分比算CDI的量更大;在0.1mo/NaOH处理的条件下1,1-环己基二乙酸单酰胺一部分转化为未知杂质,而CDA、CDI的量基本不变;而在水中处理后1,1-环己基二乙酸单酰胺基本转化为CDA、CDI。从以上图谱可以看出对照品通过酸破坏、碱破坏和氧化破坏产生的降解产物都能与CAM、CDA、CDI分离。
7、检测限和定量限
配制不同浓度的CAM、CDA、CDI对照品用流动相溶液稀释到刻度超声溶解，在上述高效液相色谱条件下分别进样20uL得到当主成份峰的信噪比在10时CAM、CDA、CDI的定量量分别为60.18ng、200.7ng、2.012ng，并且在上述量下分别对CAM、CDA、CDI进样6针得到各自的RSD分别为1.66%、1.79%、1.85%达到我们所需的定量要求。配制不同浓度的 CAM、CDA、CDI用流动相溶液稀释到刻度超声溶解，在上述高效液相色谱条件下分别进样20ul得到当主成份峰的信噪比在3时CAM、CDA、CDI的最低检出量分别为6.018ng、80.28ng、0.8048ng。
8、线性
准确称取1,1-环己基二乙酸单酰胺对照品15.046mg/mL用流动相溶液稀释到刻度超声溶解，并依次用流动相稀释成10.0236mg/mL、3.0092mg/mL、0.30092mg/mL、0.030092mg/mL、0.0060184mg/mL、0.0030092mg/mL，制成1~7号溶液，并用上述液相色谱条件分别从7号到1号依次进样,以面积(A)为纵坐标,浓度(C)作为横坐标进行线性回归。标进行线性回归。准确称取CDA对照品1.0036mg/mL用流动相溶液稀释到刻度超声溶解，并依次用流动相稀释成0.20072mg/mL、0.10036mg/mL、0.40144mg/mL、0.020072mg/mL、0.010036mg/mL,制成1~5号溶液，并用上述液相色谱条件分别从5号到1号依次进样,以面积(A)为纵坐标,浓度(C)作为横坐标进行线性回归。准确称取CDI对照品0.2012mg/mL用流动相溶液稀释到刻度超声溶解，并依次用流动相稀释成0.1006mg/mL、0.01006mg/mL、0.002012mg/mL、0.001006mg/mL、0.0001006mg/mL,制成1~6号溶液,并用上述液相色谱条件分别从6号到1号依次进样，以面积(A)为纵坐标,浓度(C)作为横坐标进行线性回归。结果显示，线性良好。
9、耐用性
本实验曾采用多种不同厂家,不同型号的ODS色谱柱检测1,1-环己基二乙酸单酰胺的相关物质，结果显示所得的CAM、CDA、CDI的面积归一法百分含量数据相差很小,分离度基本一致;少量改变流动相的比例和pH值,结果不影响分析结论且分离度影响也比较小。称取约10mg/mL CAM、CDA在不同的紫外波长下进行检测,1,1-环己基二乙酸单酰胺随着波长的减小而增大，考虑波长过低流动相可能产生干扰，而CDA在210nm左右有最大吸收,因此波长选为210nm。
参考文献
[1]柏挺,陈良平. 1,1-环己基二乙酸单酰胺及相关物质的高效液相色谱分析[J]. 浙江化工,2007,38(7):32-34. DOI:10.3969/j.issn.1006-4184.2007.07.013.