背景[1-6]
全血直接PCR试剂盒可以直接对全血样本进行PCR，无需进行DNA纯化或样品预处理，大大降低了污染风险，缩短时间和节约支出。
全血直接PCR试剂盒中包含2×Blood Master Mix，其中的血液DNA聚合酶专为全血DNA直接扩增而设计，对全血样品中的PCR抑制剂具有超强的抵抗力，可扩增全血浓度高达40%。高度优化的反应体系使得Blood direct PCR Kit能够从全血样品中高效扩增长达7.5 kb的基因组片段。扩增产物为平端，适用于HieffCloneTM快速克隆试剂盒(11001ES25/11002ES10)。另外，全血直接PCR试剂盒中配有与哺乳动物和其他许多脊椎动物兼容的引物预混液Positive control primer mix，可用于进行阳性对照反应。
全血直接PCR试剂盒可用于直接扩增的血样类型包括：新鲜血液、4℃贮存血液、冷冻血液以及储存在Whatman 903和FTA商用卡上的干血渍，且兼容所有常规抗凝剂(EDTA、柠檬酸盐、肝素等)。Blood Direct PCR Kit已经在许多哺乳动物物种上进行了成功测试，并成功扩增了几种禽类全血。
质量控制：50μl PCR体系中，以5μl人全血为模板扩增7.5 kb片段。35个循环后将1/10 PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，可见有单一的7.5 kb条带。
注意事项：
1)推荐血液模板使用量为反应总体积的1/10，即50μl的反应体系内加入5μl全血。如全血使用体积超过反应总体积的1/10，可能需要进一步调整Mg2+浓度。
2)吸取抗凝血，尤其是长期存放过的抗凝血时，应尽量避免吸取血液凝块。
3)延伸时间按30 sec/kb设定，请勿使用更长的延伸时间。
4)PCR完成后，推荐将反应液于1,000×g(大约4,000 rpm)离心1～3 min以沉淀血细胞碎片，之后取上清进行下游分析。
全血扩增引物设计注意事项：
1)引物3’端最后一个碱基选择C或G；
2)引物3’端最后8个碱基应避免出现连续错配；
3)引物3’端尽量避免出现发夹结构；
4)引物Tm值控制在60℃-72℃之间(推荐使用软件Primer Premier 5进行计算)；
5)引物额外附加序列，即与模板非配对序列，不应参与引物Tm值计算；
6)引物GC含量控制在40%-60%之间；
7)正向引物和反向引物Tm值以及GC含量尽可能一致。
应用[7][8]
全血直接PCR试剂盒可用于全血快速PCR检测：
利用全血PCR结合Pfu高保真DNA聚合酶介导的突变敏感性“分子开关”技术建立先天性耳聋4个基因10个热点突变的检测方法。方法:采集临床健康体检病人及诊断为神经性耳聋病人的血液标本,提取血液白细胞中的基因组DNA,分光光度计测定其浓度;对健康体检病人的DNA样本的耳聋基因GJB2、GJB3,SLC26 A4、线粒体DNA热点突变所在的外显子进行PCR扩增并测序,明确其基因序列,这些样本作为建立“分子开关”技术检测10个热点突变方法的标准样本。
构建10个位点的野生型和突变型质粒,作为检测的野生型和突变型模板;根据该10个位点的突变特点,设计多对突变检测引物,通过实验选择产物特异性高的引物作为突变检测引物;利用Pfu高保真DNA聚合酶和3’末端硫化修饰的突变检测引物对相应的野生型和突变模板进行扩增并测序验证扩增产物;优化PCR扩增条件,提高“分子开关”对突变位点的识别能力。分别以基因组DNA和全血作为DNA模板,重复上述检测步骤,尝试建立一种简化的PCR方法。将该方法用于20例健康人及耳聋患者的热点突变检测。
结果:对不同的热点突变位点设计的多对突变检测引物,通过实验筛选到特异性引物;在高保真DNA聚合酶介导的PCR反应体系中,3’末端硫化修饰突变检测引物对突变模板扩增得到产物,对正常模板无扩增产物,显示“分子开关”对耳聋基因热点突变位点的特异性识别。结论:成功应用全血PCR结合高保真DNA聚合酶介导的“分子开关”技术建立了耳聋基因10个热点突变的检测方法;“分子开关”技术是一种很有应用价值的点突变检测技术,全血PCR方法也是一种值得推广的方法。
参考文献
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[8]韩立影.Pfu高保真酶介导的直接全血检测耳聋基因突变热点的方法建立[D].苏州大学,2011.