简介
L-异亮氨酸(L-isoleucine，L-Ile)作为8种必需氨基酸之一，因其在人体生命活动中起到重要作用而备受关注，并且在食品和医药领域具有重要的应用前景。L-别异亮氨酸(L-allo-isoleucine，L-allo-Ile)是L-亮氨酸的一个立体同分异构体，两者的区别在于β位碳原子上的甲基构象不同：(2S,3S)L-异亮氨酸和(2S,3R)L-别异亮氨酸(图1)。L-别异亮氨酸于1958年首次被发现，在自然界中广泛存在，除了存在于槟榔科植物海枣之外，在真菌次级代谢产物中的Aureobasidin A以及放线菌次级代谢产物中球状霉素、Desotamides、Marformycins等化合物中都发现含有L-别异亮氨酸结构单元。其中L-别异亮氨酸的生物合成来源是L-异亮氨酸，纯化的DsaD/DsaE（或MfnO/MfnH）在不需要添加额外辅因子的条件下可以协作催化L-亮氨酸和L-别异亮氨酸间的可逆转化；并进一步在体外蛋白定点突变实验中证明，氨基转移酶DsaD和MfnO的催化位点分别是其第198位和第206位赖氨酸残基，异构酶DsaE和MfnH的关键催化位点分别是位于其C-端的第115位和第107位精氨酸残基[1]。
L-别异亮氨酸的性状
合成
方法一：将NaN(TMS)2（44 ml, 44 mmol）的1M溶液加入到13（12.5 g, 40 mmol）的干燥THF （500 ml）中，在-78°C下搅拌。然后，在-78℃下，滴入1N刚蒸馏的1-氯-1-亚硝基环己烷（44 ml, 44 mmol）THF溶液，继续搅拌1 h。随后，滴加1N HCl aq (140 ml)，使温度上升至室温。溶剂在真空下蒸发，残渣在1N HCl水溶液和己烷之间分配。水层用固体碳酸氢钠碱化，用CH2Cl2萃取。提取液经干燥、蒸发和层析纯化得到L-别异亮氨酸（11.0 g, 80%）[2]。
方法二：2 mM底物、4 mM碘化甲酯、40 μM s -腺苷同型半胱氨酸（SAH）、40 μM吡哆醛5-磷酸（PLP）、40 μM支链l-氨基酸转氨酶（IlvE）、40 μM α-酮酸c-甲基转移酶、20 μM卤化物甲基转移酶（HMT）和100 mM磷酸钠缓冲液（pH = 8.0）在室温下孵育1 ml反应。加入500 μl CHCl3，在涡流上剧烈搅拌24 h，使反应猝灭。用离心分离水层。冻干水层。将混合物溶解于600 μl的D2O中，冻干后得到产物L-别异亮氨酸[3]。
参考文献
[1] 纪晓奇,李青连,鞠建华. 融合表达氨基转移酶DsaD和异构酶DsaE合成L-别异亮氨酸 [J]. 微生物学通报, 2018, 45 (09): 2006-2013. DOI:10.13344/j.microbiol.china.180424.
[2] Practical synthesis of (+)-alloisoleucine By: Belzecki, Czeslaw; et al. Synthetic Communications (2000), 30(12), 2245-2252.
[3] Asymmetric β-Methylation of L- and D-α-Amino Acids by a Self-Contained Enzyme Cascade By: Liao, Cangsong; et al. Angewandte Chemie, International Edition (2020), 59(18), 7184-7187.