简介
T4DNA连接酶是一种负责DNA连接的关键工具酶，以ATP为辅基，可以连接切口、黏性末端双链DNA。T4DNA连接酶是一个分子量为55.23kDa的单链多肽（GenBank序列号：X00039.1），由487个氨基酸残基组成，基因长度为1464bp，可以催化粘端或平端双链DNA或RNA的5’-P末端和3’-OH末端之间以磷酸二酯键结合，该催化反应需ATP作为辅助因子。T4DNA连接酶是T4噬菌体的基因编码产物，能利用T4噬菌体侵染宿主细胞后，从宿主细胞裂解液中分离纯化T4-DNA连接酶，但是改工艺制备的酶含量以及质量都难以保证[1]。
随着基因工程的发展，近年来T4DNA连接酶主要由酶工程方式生产获取。目前已经报道的机理有基本一致的观点，具体为DNA连接反应机理是基于切口双链DNA底物得到的，分三步反应完成：1)ATP断裂高能磷酸键释放能量，T4DNA连接酶通过ATP供能产生E-AMP复合物；2)E-AMP复合物识别双链DNA切口位置，将AMP转移到5-P基团，形成5-P-AMP复合物；3)3-OH亲核攻击5-P-AMP形成磷酸二酯键，释放AMP。T4DNA连接酶是T4噬菌体的基因编码产物，随着基因工程的发展，近年来T4DNA连接酶主要由基因工程方法生产获得。而传统的蛋白纯化方法是镍柱，随着蛋白纯化技术的发展，近年来发展了磁珠法，多种纯化手段结合等方法进行纯化[1]。
T4DNA连接酶的性状
用途
当大肠杆菌被T4噬菌体感染后，T4DNA连接酶由噬菌体30号基因编码在宿主细胞内生成，辅助DNA复制。通过对噬菌体基因进行限制性酶切完成了对T4DNA连接基因片段的测定，还测得T4Lig蛋白的相对分子质量为55230Da，包含氨基酸487个。来自噬菌体T4的DNA连接酶是第一个依赖ATP的连接酶，也是最早被鉴定的多核苷酸连接酶之一。自从半个世纪前发现以来，T4DNA连接酶已广泛用于各种应用，它除了可以催化连接粘性末端外，还可以在没有聚乙二醇（PEG）等一些酶连接增强剂存在的环境下，催化完成平末端的连接。此外，T4DNA连接酶还可以应用在分子克隆，文库构建和高通量DNA测序以及小RNA的检测等各个方面。目前T4DNA连接酶由许多试剂公司生产，成为了常规的试剂。通过将T4DNA连接酶基因克隆到大肠杆菌，在原核细胞诱导表达，经柱层析纯化得到纯化酶[2]。
参考文献
[1] 陈波宏. 重组T4 DNA连接酶的发酵及纯化工艺研究[D]. 华南理工大学, 2020. DOI:10.27151/d.cnki.ghnlu.2020.004947.
[2] 李博. T4 DNA连接酶辅助的PCR单碱基突变检测[D]. 内蒙古大学, 2021. DOI:10.27224/d.cnki.gnmdu.2021.000336.