一种快速测定氰戊菊酯的方法

背景技术

氰戊菊酯是一种应用广泛的拟除虫菊酯类杀虫剂,对危害棉花、果蔬、茶、大豆、小麦等农作物的鳞翅目、同翅目、直翅目、半翅日害虫的幼虫有良好的防治效果,也可防治地老虎等夜蛾科害虫川。氰戊菊酯对大鼠的毒性中等,对鱼和其它水生生物毒性大。人误服氰戊菊酯可引起呕吐、神经过敏、悸惧、流诞等症状,严重时发生震颤和全身痉挛。目前,氰戊菊酯是我国拟除虫菊酯类农药中使用量最大的品种,农产品中氰戊菊酯残留超标直接影响食品安全,对环境构成一定威胁。我国强制性国家标准规定,氰戊菊酯最大残留限量:叶菜类为0.5mg/kg,谷类(原粮)、果类菜、水果为0.2mg/kg,根块类为0.05mg/kg。欧盟最近将氰戊菊酯定为农产品中不得检出的农药品种,严重影响我国茶叶等农产品的出口。

目前已报道的氰戊菊酯残留检测方法主要有高效液相色谱法、气相色谱法和气质联用法。采用这些方法需要比较昂贵的仪器设备、专业化的实验窒和训练有素的专门人才,对样品前处理的要求高、速度慢,难以适应大量祥本和现场快速检测的要求。免疫分析具有特异性强、灵敏度高、方便快捷、廉价高效、不需要贵重仪器及可多个样品同时测定等优势。国外报道以顺式氰戊菊酯整个分子的衍生物为半抗原制备免疫原,免疫动物所获抗体与其它一些结构类似的拟除虫菊酯类农药有较明显的交叉反应,所建立的间接竞争免疫分析法步骤较多。本文建立了氰戊菊酯的直接竞争酶联免疫吸附分析技术,操作简便、快速,特异性高,为氰戊菊酯残留的快速检测提供了一种新方法。

测定方法

1、氰戊菊酯人工抗原的制备与鉴定：采用活性酯法,将氰戊菊酯半抗原N-[2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酰基]4-氨基丁酸与BSA(或OVA)共价偶联,反应液在0.01mol/L pH7.2 PBS中4℃透析,偶联物冻干后于-20℃保存。精确配制偶联物、载体蛋白和半抗原溶液5mL,根据半抗原、载体蛋白质和偶联物的紫外扫描图谱鉴定半抗原是否与载体蛋白质有效偶联,根据三者在波长265nm处的摩尔吸光系数(ε)估算半杭原与载体蛋白质结合的摩尔比,结合比(X)=[(ε_偶联物-ε_载体蛋白)/ε_半抗原]。可将实验数据代入公式(M_p+XM_H)・A_c/m_c=M_p・A_p/m_p+XM_H・A_H/m_H计算(式中,(M_p+XM_H)、M_p和M_H分别为偶联物、载体蛋白和半抗原的分子量;A_c、A_p和A_H分别为偶联物、载体蛋白和半抗原溶液在265nm处的吸光值;m_c、m_p和m_H分别为配置溶液时所用偶联物、载体蛋白和半抗原的质量,X为结合比)。选择结合比15:1~30:1的偶联物作人工抗原。

2、抗体的制备与纯化：按常量法以人工抗原免疫健康新西兰白兔,免疫前兔耳缘静脉采血分离血清作阴性对照。首次用弗氏完全佐剂乳化人工抗原免疫,以后每隔两尾期用弗氏不完全佐剂乳化人工.抗原加强免疫。待琼脂双扩散法测定抗血清效价达64:1,兔颈动脉采全血分离血清,(NH₄)₂SO₄分步盐析和DEAE纤维素柱层析法分离纯化抗血清中的抗体,抗体冻干后于-20℃保存。

3、酶标半抗原的制备：采用混合酸酐法将半抗原N-[2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酰基]6-氨基己酸,与辣根过氧化物酶共价偶联,反应液在4℃条件下于0.01mol/L pH7.2 PBS中透析,用聚乙二醇浓缩至适当体积,葡聚糖凝胶G-50柱层析纯化后加等量丙三醇混匀,-20℃保存。包被抗体直接ELISA法测定酶标半抗原的效价。

4、氰戊菊酯直接竞争ELISA法的建立与条件优化：采用直接竞争ELISA模式考察氰戊菊酯对酶标半抗原与抗体结合的抑制活性,从而确定抗体与氰戊菊酯的亲合力。分别用2、4、6、8和10mg/L抗体包被聚苯乙烯微孔板,酶标半抗原稀释6000、8000、10000、12000、14000和16000倍,方阵实验法对ELISA工作条件(包括抗体和酶标半抗原的工作浓度、包被与反应介质等)进行筛选,选择氰戊菊酯对酶标半抗原与抗体结合反应的抑制率高、氰戊菊酯空白对照的A₄₉₀≈1.0、酶标半抗原和抗体用量少的实验组合为最佳工作条件组合。在优化条件下,测定不同浓度氰戊菊酯对抗原抗体结合反应的抑制率I(%),I=100[(A_对照-A_氰戊菊酯)/A_对照],绘制I对氰戊菊酯浓度(logC)的标准曲线,建立同归方程I= BlogC+A并进行相关分析,计算抑制率达50%、20%时氰戊菊酯的浓度(IC₅₀、IC₂₀),在实际样品测定时以IC₂₀为有效检出限[1]。

参考文献

[1] 尤海琴,刘浪,刘曙照. 直接竞争酶联免疫吸附分析法测定氰戊菊酯[J]. 分析化学,2009,37(4):577-580. DOI:10.3321/j.issn:0253-3820.2009.04.020.