胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）是目前已知对多巴胺能神经元最具特异性营养作用的神经营养因子之一。然而，天然GDNF作为生物大分子无法通过血脑屏障，严重限制了其在中枢神经系统疾病治疗中的直接应用。重组人GDNF蛋白的出现，结合基因工程和细胞移植技术，为解决这一难题提供了全新思路。通过构建重组人GDNF蛋白的真核表达载体，并将其导入神经干细胞或其它载体细胞，可以在病灶局部实现重组人GDNF蛋白的持续、稳定释放，从而发挥其神经保护和促再生作用。
蛋白结构
重组人GDNF蛋白属于TGF-β超家族成员，是该家族中的分泌配体。其核心结构如下：
同二聚体结构：功能性GDNF配体是以二硫键连接的同源二聚体，由两条15 kDa的多肽链（单体）组成。该二聚体的总分子量约为30.1–30.4 kDa。
半胱氨酸结结构：每条单体含有7个保守的半胱氨酸残基，其中Cys-101参与链间二硫键桥接，其余半胱氨酸参与形成被称为“半胱氨酸结”的分子内环结构。半胱氨酸结是TGF-β超家族生长因子的典型结构特征，赋予蛋白稳定的二聚体构型。
氨基酸组成：成熟肽链长度为134个氨基酸。大鼠与人的成熟GDNF具有93%的序列一致性，存在物种交叉反应性。
使用与储存注意事项
重组人GDNF蛋白通常以冻干粉形式供应，应在-20℃至-70℃条件下储存。冻干品在提供条件下可稳定保存12个月。复溶后的溶液在无菌条件下于2–8℃可保存1个月，在-20℃至-70℃可分装后保存3个月。应注意避免反复冻融循环，这可能会导致蛋白降解。建议将原管短暂离心后开盖，以避免冻干粉末飘散。
重组人GDNF蛋白基因的克隆与载体构建[1,2]
获得高质量的重组人GDNF蛋白编码序列是开展基因修饰研究的第一步。研究以人星形胶质瘤U251细胞和人神经胶质细胞瘤组织中，成功克隆出重组人GDNF蛋白基因，其选择性剪接变体仍保留生物学活性。
为了在哺乳动物细胞中高效表达重组人GDNF蛋白，两项研究分别构建了不同类型的真核表达载体。研究结论的得出，重组人GDNF蛋白真核表达载体（如pEGFPN1-GDNF和pLXSN-RES2-EGFP-GDNF）可被成功构建，EGFP融合表达或IRES连接策略为监测转染和表达提供了便利。
重组人GDNF蛋白在细胞中的表达与鉴定[1,2]
重组人GDNF蛋白基因可经脂质体或FuGENE HD转染试剂高效导入神经干细胞或包装细胞，经G418筛选可获得稳定表达的细胞克隆。且包装细胞在哺乳动物细胞中的有高效表达性，为后续重组逆转录病毒的收集和骨髓间充质干细胞的转染奠定了基础。
重组人GDNF蛋白修饰神经干细胞的功能特性[1,2]
重组人GDNF蛋白的稳定表达不影响神经干细胞的自我更新和多向分化潜能，且分化后细胞仍能持续表达重组人GDNF蛋白。同时该细胞具有分化为TH阳性多巴胺能神经元的能力，为帕金森病的细胞移植治疗提供了理想的种子细胞。
重组人GDNF蛋白在帕金森病治疗中的意义
帕金森病的主要病理特征是黑质致密部多巴胺能神经元的进行性变性丢失。重组人GDNF蛋白因其对多巴胺能神经元的特异性营养作用，被公认为最有前途的帕金森病治疗候选分子之一。然而，外源性给予重组人GDNF蛋白难以跨越血脑屏障，且脑内直接注射存在分布不均、需要反复给药等问题。
以神经干细胞或骨髓间充质干细胞为载体，通过基因工程技术使其稳定表达重组人GDNF蛋白，然后进行立体定向移植，是解决上述给药难题的理想策略。研究中成功建立的GDNF基因修饰大鼠胚胎中脑神经干细胞，构建的逆转录病毒介导的重组人GDNF蛋白表达系统[1,2]，均为这一策略的实施提供了关键的技术平台和实验依据。
参考文献
[1] 邓兴力, 刘如恩, 郭京, 等. GDNF基因修饰大鼠胚胎中脑神经干细胞的建立[J]. 中风与神经疾病杂志, 2008, 25(3): 260-264.
[2] 陈睿, 刘雪平, 郭春红, 等. 重组人GDNF基因逆转录病毒真核表达载体的构建及表达[J]. 中国老年学杂志, 2010, 30(10): 1398-1401.