简介
人正常肝细胞WRL68是常用永生化正常肝细胞株，保留肝细胞葡萄糖代谢等生理功能，适用于氧化应激、胰岛素抵抗相关体外研究。通常选用3-5代稳定细胞开展实验。经H₂O₂氧化损伤后，细胞脂质过氧化产物MDA升高，伴随凋亡相关Annexin-V表达上调，增殖与葡萄糖利用能力下降,高浓度过氧化氢长期刺激会引发细胞膜破裂、细胞崩解，糖代谢紊乱进一步加重。
人正常肝细胞WRL68的形态
培养方法
人正常肝细胞WRL68的复苏：从液氮罐中取出保存的冻存管，迅速投入37℃温水中，轻轻摇动使内容物尽快融化。用酒精消毒后开启并用吸管吸出细胞悬液，加入预先加有6ml完全培养液的离心管，混合后800rpm/min离心5min，除去上清液。用培养液适当稀释后，接种培养瓶，并放入CO₂培养箱培养，次日更换培养液，继续培养。如果复苏时人正常肝细胞WRL68密度较高要及时传代，细胞复苏时细胞数可以做10-20倍稀释，接种密度以5×10⁵个细胞/ml为宜。
人正常肝细胞WRL68的培养：①培养瓶中的人正常肝细胞WRL68覆盖率达到80%-90%时进行传代。②吸弃原有培养基，加入2ml的PBS清洗细胞后弃掉。③加适当的胰蛋白酶（能覆盖细胞就行），消化1-2分钟。④细胞都变圆后吸出胰酶终止消化。⑤加入3ml的完全培养基，移液枪吹打细胞，把细胞都悬浮起来。⑥把细胞传到3个相同规格的培养瓶中，置于37℃，5% CO₂培养箱中继续培养。⑦以生长稳定的3-5代人正常肝细胞WRL68制备细胞悬液，接种于6孔板，每孔细胞数约为5×10⁵个，用于实验[1]。
H₂O₂氧化损伤对人正常肝细胞WRL68糖代谢及凋亡的影响
实验观察到，人正常肝细胞WRL68培养24h，其培养基中残余葡萄糖含量较0h时明显减少，即葡萄糖被充分利用、供能，维持代谢的需要。而当其遭受低浓度的H₂O₂损伤后，随着MDA含量逐步上升、Annexin-V表达逐步增强，而细胞的增殖率、培养基中葡萄糖含量则呈逐渐下降趋势，明显低于同期未受H₂O₂损伤组。分析其原因很可能是因为H₂O₂的膜损伤作用使脂质过氧化自由基、MDA生成，细胞Ga²⁺超载，细胞膜出现Annexin-V高表达、磷脂酰丝氨酸翻转等细胞凋亡现象，使细胞功能及细胞膜受体功能受损，代谢功能障碍，葡萄糖不能得以很好的消化利用，出现残余培养基中葡萄糖含量高于正常组这一胰岛素抵抗现象。而在高浓度H₂O₂组，12h时MDA含量、Annexin-V表达均陡然升高，细胞增殖率明显下降，葡萄糖含量亦高于低浓度组，反映WRL68细胞此时已遭受严重的损伤，而至24hMDA含量、Annexin-V表达不升反降，WRL68细胞增殖率更加下降，葡萄糖含量较低浓度组更高，很可能与此时长期持续的较高浓度的过氧化损伤导致部分细胞膜破裂、细胞崩解、细胞膜上各种生化反应不能进行，此时葡萄糖的消化利用障碍、胰岛素抵抗现象更为严重所致[1]。
参考文献
[1] 徐建华. 人正常肝细胞过氧化损伤时受体及受体后水平胰岛素抵抗现象[D]. 南方医科大学, 2014.a