介绍
L-环己基丙氨酸（L-Cyclohexylalanine，简称Cha）是一种广泛应用于多肽药物化学的非天然氨基酸，其侧链为饱和环己基结构，具有强疏水性与空间刚性，常被用于替代亮氨酸、苯丙氨酸等天然疏水氨基酸，在不破坏多肽二级结构的前提下，增强配体与靶点的疏水相互作用，同时提升多肽对蛋白酶水解的抗性。
图一 L-环己基丙氨酸
结构特征
L-环己基丙氨酸的分子结构与天然亮氨酸相似，但侧链由异丁基替换为体积更大、疏水性更强的环己烷环，环己基的强疏水作用可填补受体结合口袋的疏水空腔，通过范德华力与疏水效应增强配体-靶点的结合能，显著提升结合亲和力；饱和六元环的空间刚性可稳定多肽的α-螺旋等二级结构，减少构象熵损失，进一步提高结合的稳定性；作为非天然氨基酸，它无法被体内蛋白酶识别切割，能够有效延长多肽的体内半衰期，改善代谢稳定性。
应用
在促胰液素受体拮抗剂中的引入
为解决亲和力丢失的问题，先通过在多肽序列中引入Glu16-Lys20内酰胺桥，稳定配体的α-螺旋构象，构建了(Y¹⁰,c[E¹⁶,K²⁰])sec(5–27)，将亲和力提升至30nM，但仍远低于天然配体水平。在此基础上，研究者结合同源模建与分子动力学模拟，对受体-配体结合模式进行解析，发现配体第22位亮氨酸（Leu²²）正对受体胞外结构域（ECD）结合槽底部的疏水区域，周围环绕着Leu³¹、Val³⁴与Phe⁹²三个疏水残基。由于天然Leu的侧链体积有限，无法充分填充该疏水空腔，存在明显的结合能提升空间。提出将Leu²²替换为侧链更庞大、疏水性更强的L-环己基丙氨酸，通过增强疏水相互作用进一步提升配体亲和力。
对配体结合亲和力的提升效应与位点特异性
以内酰胺稳定的sec(5–27)为母核，分别将序列中第19、22、23、26位的天然亮氨酸逐一替换为Cha，合成系列类似物并测定受体结合亲和力。仅第22位的L-环己基丙氨酸替换（Cha²²）能显著提升配体亲和力，类似物(Y¹⁰,c[E¹⁶,K²⁰],Cha²²)sec(5–27)的结合亲和力Ki达到6nM，较母核提升了5倍；而第19、23、26位的Cha替换对亲和力无明显改善，说明只有当修饰位点与受体疏水口袋精准匹配时，Cha才能发挥疏水增强效应。
在Cha²²修饰的基础上，进一步整合了已被验证的亲和力提升突变，第17位丙氨酸突变为异亮氨酸（Ile¹⁷）、第25位甘氨酸突变为精氨酸（Arg²⁵），最终得到多重修饰的类似物(Y¹⁰,c[E¹⁶,K²⁰],I¹⁷,Cha²²,R²⁵)sec(5–27)。该配体的结合亲和力达到4nM，与天然促胰液素完全相当，较原始截短肽sec(5–27)提升了180倍，让N端截短的拮抗剂配体恢复了天然配体级别的高亲和力。
图二 提高sec(5–27)类似物作为潜在SecR拮抗剂的结合亲和力
亲和力增强的分子机制
在优化的受体-配体复合物模型中，Cha²²的环己基侧链完全嵌入受体ECD结合槽底部的疏水空腔，与Leu³¹、Val³⁴、Phe⁹²的侧链形成紧密的疏水堆积，大幅增加了配体与受体的疏水接触面积，通过范德华力与疏水效应显著降低了结合自由能。Leu³¹/Val³⁴双突变与Phe⁹²单突变均导致天然促胰液素的受体激活活性显著下降，直接证明该疏水区域是配体结合的关键位点，也从侧面印证了Cha²²与该区域的疏水相互作用是亲和力提升的核心驱动力。此外，L-环己基丙氨酸的刚性环己基还能在一定程度上稳定多肽C端的螺旋构象，减少配体结合过程中的构象熵损失，进一步促进高亲和力复合物的形成。
L-环己基丙氨酸修饰的优势在于仅增强结合亲和力，而不会重新引入受体激动活性。在正常表达水平的SecR细胞中，(Y¹⁰,c[E¹⁶,K²⁰],I¹⁷,Cha²²,R²⁵)sec(5–27)无明显的cAMP激活、胞内钙动员与β-arrestin-2招募活性，保持了纯拮抗剂的功能特性。仅在受体过表达的细胞系中，该配体表现出极弱的部分激动活性。
得益于L-环己基丙氨酸介导的强疏水结合作用，截短后的(Y¹⁰,c[E¹⁶,K²⁰],I¹⁷,Cha²²,R²⁵)sec(6–27)仍维持了4nM的高结合亲和力，且在任何受体表达水平下均无任何可检测的激动活性，成为真正的高亲和力正位竞争性拮抗剂。无L-环己基丙氨酸修饰的天然截短肽在截短至sec(6–27)后，亲和力会出现断崖式下降，无法实现活性与亲和力的平衡[1]。
参考文献
[1]Dong, Maoqing, Harikumar, Kaleeckal G., Raval, Sweta R., et al. Rational development of a high-affinity secretin receptor antagonist[J]. Biochemical Pharmacology,2020,177113929. DOI:10.1016/j.bcp.2020.113929.